تلطيخ H& E لأقسام الأنسجة المضمنة في البارافين: تقنية تلطيخ تفاضلي لتصور أقسام أنسجة الكبد باستخدام مزيج من أصباغ الهيماتوكسيلين والإيوزين

Abstract

المصدر: Ellis، J. L et al.، تحليلات نسيجية لإصابة الكبد الكحولية الحادة في الزرد. J. Vis. Exp. (2017).

في هذا الفيديو ، نصف تقنية تلوين الهيماتوكسيلين والأيوزين لأقسام الأنسجة المضمنة في البارافين لدراسة الأنسجة. يتضمن الإجراء إزالة الأنسجة متبوعا بتلوين الخلايا في الأنسجة. عند التلوين ، تظهر النواة زرقاء بشكل واضح ، وتظهر البروتينات الموجودة في السيتوبلازم اللون الوردي.

Protocol

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير محاليل التلوين

1. قم بتصفية محلول مخزون هاريس الهيماتوكسيلين لإزالة أي مواد صلبة ترسب.
2. قم بطي مرشح القهوة إلى نصفين بحيث يخلق الفلتر مخروطيا. افتح اللوحة الجانبية بحيث يمر السائل عبر الفلتر ، مما يسمح بالتقاط أي حطام.
3. ضع الفلتر داخل قمع والقمع في زجاجة وسائط زجاجية. صب الهيماتوكسيلين تدريجيا من خلال الفلتر.
   أنذر: الهيماتوكسيلين خطير في حالة ملامسة العين والابتلاع والاستنشاق. ارتد دائما معطف المختبر والقفازات وتعامل مع محلول المرق في غطاء كيماوي.
4. تحضير 0.05٪ حمض الهيدروكلوريك عن طريق إضافة 125 ميكرولتر من 12 نيوتن حمض الهيدروكلوريك إلى 250 مل من ddH₂O.
5. تحضير خليط محلول اليوزين Y-phloxine B عن طريق الجمع بين 25 مل من 1٪ يوزين Y (aq) ، و 2.5 مل من 1٪ الفلوكسين B (aq) ، و 195 مل من 95٪ إيثانول ، و 1 مل من حمض الخليك الجليدي في زجاجة زجاجية. تخلط جيدا عن طريق التحريك وتخزن في RT
   أنذر: يعتبر Eosin Y خطيرا في حالة ملامسة العين والابتلاع والاستنشاق. ارتد دائما معطف المختبر والقفازات وتعامل مع محلول المرق في غطاء كيماوي.
6. تحضير 2٪ إيثانول بإضافة 2 مل من الكحول الإيثيلي النقي إلى 98 مل من ماء البيض.
   أنذر: الكحول الإيثيلي مهيج للعين. ارتد دائما معدات الحماية المناسبة عند التعامل مع الكحول الإيثيلي. كما أنها قابلة للاشتعال ويجب التعامل معها وتخزينها وفقا لذلك.
   ملاحظة: قم بإعداد الإيثانول الطازج بنسبة 2٪ في كل مرة قبل إجراء معالجة الإيثانول الحاد.

فئة

2. تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين لأقسام البارافين

1. قم بإزالة الشرائح عن طريق غمسها في 100٪ زيلين لمدة 15 دقيقة ؛ قم بتغييرها إلى زيلين طازج بنسبة 100٪ لمدة 15 دقيقة أخرى.
2. أعد ترطيب الشرائح عن طريق غمسها من خلال السلسلة التالية من الإيثانول المتدرج حتى يتدفق السائل بشكل نظيف من الشرائح. لكل محلول ، اغمس 8-10 مرات ، 2 ثانية لكل غمس: 100٪ إيثانول ، 100٪ إيثانول ، 95٪ إيثانول ، 95٪ إيثانول ، 70٪ إيثانول ، 50٪ إيثانول ، 30٪ إيثانول ، وماء منزوع الأيونات.
   ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول هنا ، ويمكن ترك الشرائح في RT في الماء لعدة ساعات. إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية في الماء O / N.
3. ضع الشرائح في هيماتوكسيلين هاريس المصفى بنسبة 100٪ لمدة 4 دقائق. انقلها على الفور مرة أخرى إلى الحاوية بالماء منزوع الأيونات. قم بتشغيل الماء منزوع الأيونات في الزاوية الخلفية للحاوية بعيدا عن الأقسام. أفرغ الحاوية بشكل دوري حتى يختفي الماء من اللون الأرجواني.
   ملاحظه: لا تدع الماء يتدفق مباشرة على الشرائح ، حيث قد تخرج الأقسام من الشرائح.
4. تحقق بسرعة من شدة الهيماتوكسيلين على مجهر تشريح باستخدام مصابيح معقوفة ؛ لا تدع الشرائح تجف. إذا وصلت البقعة إلى الشدة المطلوبة ، فتابع إلى الخطوة التالية. إذا لم يكن اللون داكنا بدرجة كافية ، فضع الشرائح في هيماتوكسيلين بنسبة 100٪ لمدة 1 دقيقة وكرر غسل الماء قبل التحقق مرة أخرى.
   ملاحظه: يجب أن يكون الهيماتوكسيلين داكنا بدرجة كافية حتى لا يضيع اللون أثناء تلطيخ اليوزين. ومع ذلك ، إذا شوهد تلطيخ الهيماتوكسيلين في السيتوبلازم ، فإن الأقسام تكون ملطخة.
5. اغمس الشرائح مرتين في 0.05٪ حمض الهيدروكلوريك وانقلها على الفور مرة أخرى إلى الحاوية بماء نظيف منزوع الأيونات. أفرغ الماء وأعد ملء الحاوية بالماء مرتين.
6. انقل الشرائح إلى 95٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية ثم انقلها إلى حاوية جديدة تحتوي على 95٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية.
7. ضع الشرائح في محلول الإيوزين Y-Phloxine B لمدة دقيقتين ، انقل الشرائح مرة أخرى إلى حاوية الإيثانول السابقة بنسبة 95٪ وتحقق بسرعة من شدة اللون تحت مجهر التشريح. إذا كان التلوين كافيا ، فانتقل إلى الخطوة التالية. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فارجع إلى محلول اليوزين لمدة 30 ثانية ، وتحقق مرة أخرى ، وكرر ذلك حسب الضرورة.
   ملاحظه: تلطيخ اليوزين الكافي هو اللون الوردي الفاتح ويظهر في تناقض واضح مع صبغة الهيماتوكسيلين. تأكد من مسح أي محلول من الجزء الخلفي من الشرائح عند التحقق تحت المجهر حتى لا يلاحظ أي لون زائف. نظرا لأن اليوزين يتكون من 95٪ من الإيثانول ، فإن فترات طويلة من الوقت في 95٪ من الإيثانول أثناء التحقق من كثافة اللون قد تتسرب إلى بعض اللون.
8. انقل الشرائح إلى 100٪ من الأيزوبروبانول لمدة 15 ثانية. استبدلها بالأيزوبروبانول الطازج بنسبة 100٪ وضع الشرائح مرة أخرى في الأيزوبروبانول لمدة 15 ثانية أخرى. كرر هذه العملية ليصبح المجموع 6 غسلات من الأيزوبروبانول.
   أنذر: الأيزوبروبانول هو مهيج للعين والجهاز التنفسي. تأكد دائما من ارتداء معدات الحماية المناسبة وتجنب تناثرها. كما أنها شديدة الاشتعال ويجب تخزينها والتعامل معها وفقا لذلك.
   ملاحظه: لتوفير الكواشف ، تخلص فقط من أول غسول (وردي) للأيزوبروبانول. احتفظ بمحاليل الغسيل الخمسة الأخرى في زجاجات مرقمة من 1 إلى 5 ، لإعادة استخدامها في التلوين التالي. عند إعادة استخدام الغسالات ، ابدأ بالزجاجة المرقمة "1" وتخلص منها بعد الاستخدام. بمجرد استخدام الغسيل "2" ، اسكبه في الزجاجة "1" وهكذا. يجب أن يكون الغسيل النهائي دائما من الأيزوبروبانول الطازج.
9. ضع الشرائح في زيلين بنسبة 100٪ لمدة 3 دقائق. قم بإزالة شريحة واحدة في كل مرة وضع قسيمة غطاء.
   1. أضف وسيطا تركيب كافيا لتغطية الأقسام واغمسها في 100٪ زيلين.
      ملاحظه: ستعمل هذه الخطوة على تنعيم سطح وسط التثبيت وإزالة أي فقاعات.
   2. ضع غطاء على الجزء السفلي من الشريحة.
      ملاحظه: يجب أن يسحب وسيط التثبيت الشريحة إلى موضعها. إذا لم يكن الغطاء مستقيما أو مثبتا تماما، فاضغط عليه برفق في مكانه.
   3. امسح أي وسيط تركيب زائد على منشفة ورقية حتى يظهر خط رفيع فقط. اغمس منديل في الزيلين وامسح الجزء الخلفي من الشريحة لإزالة أي وسيط متساقط. ضع الشريحة بشكل مسطح على سطح قوي ولكن متحرك ، مثل قطعة من الورق المقوى. غطاء جميع الشرائح المتبقية بنفس الطريقة. اترك الزيلين يتبخر في الغطاء لمدة 10 دقائق.
      ملاحظه: يجب إزالة أي مواد ملوثة بالزيلين والتخلص منها في حاوية محكمة الغلق في غطاء المحرك لمنع أي أبخرة من الهروب.
10. اسمح لوسط التركيب بالتصلب عند RT O / N.

< p class = "jove_title" >3. تصوير وتخزين الشرائح الملطخة

1. أقسام الصورة على مجهر مقلوب مركب.
   ملاحظه: يمكن الاحتفاظ بالشرائح في درجة حرارة الغرفة إلى أجل غير مسمى.

Materials