تمت مراجعة جميع إجراءات النموذج الحيواني من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. معالجة الأنسجة
ملاحظة: يجب أن تتم جميع الخطوات في هذا القسم باستخدام تقنية معقمة.
- قم بتسمية 1 15 مل أنبوب مخروطي لكل فأر وأضف 2.5 مل من خليط الكولاجيناز من النوع الرابع و 30 وحدة من الإيلاستاز لكل أنبوب. لصنع خليط الكولاجيناز من النوع الرابع ، قم بإذابة 2 مجم من الكولاجيناز من النوع الرابع لكل مل 1x HBSS وفلتر معقم. يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 12 شهرا عند -20 درجة مئوية وإذابتها عند الحاجة.
- انقل رئة الفأر المحصودة إلى الثانية ، ونظف 1x HBSS جيدا لتلك العينة. قم بالتدوير باستخدام الملقط لإزالة أي دم متبقي. انقل الرئة النظيفة إلى صفيحة زراعة الأنسجة الفارغة مقاس 3.5 سم. فرم الرئة بالمقص. اشطف الطبق ب 2.5 مل من 1x HBSS ، وانقل 1x HBSS وقطع الرئة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي بالفعل على كوكتيل الكولاجيناز / الإيلاستاز (إجمالي 5 مل).
- احتضن لمدة 75 دقيقة عند 4 درجات مئوية. استمر في خلط العينات خلال هذا الوقت ، لذا ضع الأنابيب على الروك أو العجلة الدوارة. خلال خطوة الحضانة هذه ، قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل وألواح زراعة الأنسجة 10 سم لكل فأر. في حالة إجراء التخفيف ، قم بتسمية ما يكفي من ألواح زراعة الأنسجة مقاس 10 سم للتخفيفات.
ملاحظه: قم بتسمية غطاء ألواح زراعة الأنسجة. في حالة وضع العلامات على اللوحة نفسها ، ستتداخل الكتابة مع تحليل Fiji-ImageJ.
- ارفع حجم كل أنبوب إلى 10 مل إجمالا مع 1x HBSS. صب المحتويات فوق مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل لكل عينة. استخدم مكبس حقنة سعة 1 مل لطحن العينة برفق من خلال المصفاة للسماح لمزيد من الخلايا بالترشيح من خلالها.
- جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 350 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT). تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات ب 10 مل من 1x HBSS. كرر هذه الخطوة مرتين.
- أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسائط الثقافة الكاملة 60 ميكرومتر 6TG ، إما RPMI أو IMDM. عينات من الألواح في ألواح زراعة الخلايا مقاس 10 سم ، باستخدام مخطط التخفيف إذا رغبت في ذلك. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5 أيام.
ملاحظة: 1: 2 و 1:10 و 1: 100 هي تخفيفات شائعة ستحتاج إلى تحديدها تجريبيا بناء على معلمات الدراسة.
تحذير: 6TG سامة. توخي الحذر عند التعامل واتبع جميع إرشادات الصحة والسلامة البيئية للتخلص منها.
< ص الفئة = "jove_title" >
2. لوحات تلطيخ
- صب وسائط الثقافة من الأطباق في حاوية النفايات المناسبة. قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 5 مل من الميثانول غير المخفف لكل طبق واحتضانه لمدة 5 دقائق في RT ، مع التأكد من تحريك الميثانول بحيث يغطي اللوحة بأكملها.
أنذر: الميثانول خطير إذا تم تناوله أو استنشقه أو وضعه على الجلد. استخدم غطاء الدخان لهذه الخطوة.
- صب الميثانول من الأطباق في حاوية النفايات المناسبة. اشطف الأطباق ب 5 مل من الماء المقطر لكل طبق واسكب الماء في حاوية النفايات المناسبة. أضف 5 مل من 0.03٪ من الميثيلين الأزرق لكل طبق واحتضنه لمدة 5 دقائق في RT ، مع التأكد من تحريك محلول الميثيلين الأزرق بحيث يغطي اللوحة بأكملها.
- صب الميثيلين الأزرق في حاوية النفايات المناسبة. اشطف الأطباق مرة أخرى ب 5 مل من الماء المقطر لكل طبق. اقلب الأطباق رأسا على عقب وامسح منشفة ورقية لإزالة السوائل الزائدة. ضع الطبق على غطاءه واتركه يجف في الهواء طوال الليل عند RT.
ملاحظه: ستكون المستعمرات النقيلية زرقاء. بمجرد تجفيف الأطباق ، يمكن تخزينها في RT إلى أجل غير مسمى.
