تلطيخ الخلايا بالحمض الدوري: تقنية في المختبر للكشف عن مستويات الجليكوجين في خلايا الدم المحيطية أحادية النواة

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

ملاحظة: قم بتنفيذ هذا الإجراء في خزانة السلامة الحيوية باستخدام تقنية معقمة ومعدات معقمة من قبل الشركة المصنعة.

1. صب بعناية 10-15 مل من الدم الكامل من أنابيب جمع الدم الهبارين (المضادة للتخثر) في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. بالنسبة لانسكابات الدم الطفيفة ، امسح باستخدام ddH₂O و 70٪ EtOH باستخدام مناديل التنظيف.
2. قم بتخفيف الدم في الأنبوب المخروطي إلى نسبة 1: 1 باستخدام محلول ملحي للفوسفات (PBS 1x) درجة الحموضة 7.4. تأكد من أن الحد الأقصى للحجم الكلي لا يتجاوز 30 مل.
3. امزج برفق باستخدام مسدس ماصة مصلي لتجنب الفقاعات.
   ملاحظه: لا تخلط عن طريق قلب الأنبوب لتجنب تراكم الدم في الغطاء والتسرب اللاحق أثناء الطرد المركزي.
4. أضف 13 مل من Ficoll-paque (انظر جدول المواد) ، إلى أنبوب مخروطي جديد بسعة 50 مل. احتفظ بالأنبوب في وضع مستقيم في الرف.
5. باستخدام ماصة النقل ، خذ الدم المخفف ، المس طرف ماصة النقل بالجدار الداخلي للأنبوب بالقرب من الجزء العلوي. بضغط بطيء وثابت ، انقل الدم على طول الجدار الداخلي للأنبوب لتشكيل طبقة دم فوق طبقة السكروز. قم بهذه الخطوة عدة مرات حتى يتم نقل الدم بالكامل.
6. قم بتغطية الأنبوب بإحكام وقم بالطرد المركزي للأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة عند 700 × جم في دوار متأرجح مع ضبط تسارع متوسط على 5 ، وضبط التباطؤ على صفر.
7. أخرج الأنبوب ببطء ودون إزعاج الطبقات ، أعده إلى خزانة السلامة الحيوية.
8. اجمع بعناية طبقة مصفرة (طبقة بيضاء رقيقة غائمة) ، حيث توجد PBMCs ، موضوعة بين طبقات PBS / البلازما و ficoll باستخدام ماصة النقل. تجنب جمع طبقة السكروز ولا تزعج طبقة خلايا الدم الحمراء.
9. انقل الطبقة المصفرية إلى أنبوب مخروطي معقم جديد سعة 50 مل. قد يستغرق الأمر عدة مرات من تكرار الخطوة 1.8 لتجميع كل PBMC.
10. أضف PBS درجة الحموضة 7.4 إلى الأنبوب باستخدام PBMC واملأ حتى علامة 45 مل. رج الأنبوب جيدا. لا تدوام.
11. الغسيل 1: جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 480 × جم مع ضبط الحد الأقصى للتسارع والتباطؤ على 9. لاحظ تكوين حبيبات من PBMCs في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي.
12. تخلص من PBS (المادة الطافية) في دورق بلاستيكي مع 10 مل من المبيض.
قم
13. بفك حبيبات الخلية عن طريق "الأرفف" برفق على سطح متموج (أي رف فارغ). لا تدوام.
14. أضف 25 مل من PBS الطازج الرقم الهيدروجيني 7.4 إلى الأنبوب. إذا تمت معالجة أكثر من أنبوب واحد ، فقم بتجميع الكريات معا في هذه الخطوة.
15. اغسل 2: قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 12 دقيقة عند 480 × جم مع ضبط الحد الأقصى للتسارع والتباطؤ على 9.
16. تخلص من PBS (المادة الطافية) في الدورق البلاستيكي مع رشة من المبيض.
17. "رف" برفق على سطح متموج (أي رف فارغ). لا تدوام.
18. أضف 25 مل من PBS الطازج إلى الأنبوب.
    1. أخرج 50 ميكرولتر من الخلايا وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق لحساب الجدوى.
    2. أضف كمية متساوية (50 ميكرولتر) من التريبان الأزرق (بقعة قابلة للحياة) وقم بالماصة لأعلى ولأسفل لخلطها برفق.
19. أخرج 10 ميكرولتر وانقله إلى مقياس كثافة الدم للتحقق من صلاحية الخلايا لكل مل. سجل عدد الخلايا / مل.
20. أخرج الكمية المطلوبة من الخلايا وقم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 12 دقيقة عند 480 × جم مع ضبط الحد الأقصى للتسارع والتباطؤ على 9.
21. تخلص من PBS (طاف) في الدورق مع المبيض.
22. "رف" برفق على سطح متموج (أي رف فارغ). أضف 80 ميكرولتر من PBS إلى الأنبوب.

2. عمل شريحة PBMC

1. ضع 80 ميكرولتر من الخلايا على شريحة مجهرية. قم بتشويه القطرة بمساعدة شريحة أخرى أو ضع قطرتين من 40 ميكرولتر لكل منهما على طرفي الشريحة.
2. اترك الشريحة في خزانة السلامة البيولوجية حتى تجف. قم بتسمية الشريحة بقلم رصاص على الجانب المصنفر.

3. إصلاح العينات على الشرائح

1. تحضير المحلول المثبت عن طريق خلط 0.5 مل من 37٪ فورمالديهايد مع 4.5 مل من 99٪ إيثانول.
2. بعد تجفيف الشرائح ، أخرج 2 مل من محلول التثبيت الطازج واسكبه على الشريحة بحيث يتم تغطية سطح الشريحة بالكامل.
3. اترك المحلول على الشريحة لمدة 1 دقيقة. اشطف الشريحة لمدة 1 دقيقة بماء الصنبور واتركها حتى تجف في الهواء.

1. خذ 0.25 غرام من مسحوق الأميليز وقم بإذابة 50 مل من الماء المقطر. صب المحلول في دورق نظيف 100 مل.
2. اغمر الشريحة في الدورق بحيث يتلقى نصف الشريحة العلاج ويظل النصف الآخر غير معالج ثم يحتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 1 ج).
3. قم بتدوين أي جانب من الشريحة يتلقى علاج الأميليز. ارسم خطا على الجزء الخلفي من الشريحة يشير إلى الحدود بين العلاج والتحكم.
4. اغسل الشرائح باستخدام ddH₂O لإزالة محلول الأميليز واترك الشريحة حتى تجف في الهواء.

ملاحظة: كواشف PAS سامة عن طريق الاستنشاق وهي قابلة للتآكل ، لذلك يجب القيام بالخطوات في غطاء الدخان الكيميائي ، ويجب التخلص من النفايات بشكل صحيح وفقا للإرشادات المؤسسية.

1. ضع الشريحة على سطح مستو واسكب 1.50-2.00 مل من محلول الحمض الدوري على العينة. احتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. شطف الشرائح في عدة شحنات من الماء المقطر.
3. صب 1.50-2.00 مل من كاشف شيف على الشريحة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
4. اغسل الشريحة بالماء المقطر لمدة 5 دقائق واتركها لتجف في الهواء.
5. ضع وسائط تثبيت سعة 10 ميكرولتر على الشريحة وقم بتغطيتها بغطاءين صغيرين ، أو ضع 50 ميكرولتر واستخدم غطاء واحد كبير.
6. ضعي طلاء أظافر شفاف على حواف الغطاء ، واتركيه يجف طوال الليل.

6. احصل على الصور باستخدام المجهر الضوئي المجهري باستخدام هدف 100X

الشكل 1: منهجية خطوة بخطوة لتلوين PAS على PBMC.(أ) أولا ، يتم تحقيق عزل PBMC من خلال تدرج ficoll ، وتظهر اللوحة اليسرى التحضير قبل الطرد المركزي ، وتظهره اللوحة اليمنى بعد الطرد المركزي حيث لوحظ الطبقة المصفاة التي تحتوي على PBMC في وسط الأنبوب. (ب) يتم تثبيت PBMCs المعزولة على الشريحة باستخدام محلول تثبيت الفورمالين والإيثانول. يتم شطف الشريحة برفق بالماء المقطر من زجاجة غسيل بلاستيكية. (ج) ثم توضع الشريحة في دورق سعة 100 مل مملوءة بمحلول الأميليز ، والذي سيذيب الجليكوجين. يتم شطف الشريحة بلطف. (د) تتم معالجة الشريحة بمحلول حمضي دوري ، حيث تتم أكسدة السكريات. يتم شطف الشرائح بلطف. سيؤدي ذلك إلى إزالة الحمض الدوري الزائد وإيقاف خطوة الأكسدة. (ه) عند إضافة كاشف شيف إلى الشرائح ، فإنه سيتفاعل مع الألدهيدات التي تم إنشاؤها أثناء خطوة الأكسدة. سينتج عن هذا الكاشف عديم اللون بعد ذلك منتج أرجواني أحمر غامق. يتم شطف الشرائح برفق لإزالة كاشف Schiff الزائد.