تلطيخ البنفسجي الكريستالي: تقنية لتصور الخلايا السرطانية المقاومة للأدوية باستخدام فحوصات تكوين المستعمرة

الملخص

المصدر: Mohr، L. et al. ، جيل من نماذج خلايا سرطان البروستاتا لمقاومة العامل المضاد للانقسام Docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)

في هذا الفيديو ، نوضح مقايسة صلاحية الخلية باستخدام إجراء تلطيخ بنفسجي بلوري للخلايا السرطانية المقاومة للأدوية الكيميائية.

البروتوكول

فئة

1. التوصيف الوظيفي لمقاومة الدوسيتاكسيل المكتسبة عن طريق فحص تكوين المستعمرة

ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم تقييم المقاومة الكيميائية باستخدام فحوصات تكوين المستعمرة. يمكن استخدام الطرق البديلة المستخدمة لتقييم صلاحية الخلية (أي فحوصات MTS) بناء على تفضيلات المحققين.

1. لوحة 2,000 خلية (DU145 أو 22Rv1 ، مقاومة للوالدين ومقاومة Docetaxel) لكل بئر في ألواح 6 آبار ، باستخدام 2 مل من الوسائط لكل بئر.
2. بعد 24 ساعة ، أضف تركيزات متزايدة من Docetaxel (الخلايا الأبوية: 0.25 و 0.5 و 1 و 2.5 و 5 نانومتر. خلايا DR: 50 و 125 و 250 و 500 و 1,000 نانومتر) لكل من خطوط الخلايا DU145 و 22Rv1. أضف DMSO إلى بئر واحد فقط كعنصر تحكم بنفس الحجم المستخدم لأعلى جرعة من Docetaxel.
3. بعد 72 ساعة ، قم بشفط الوسائط التي تحتوي على الدواء وأضف وسائط جديدة خالية من الدوسيتاكسل.
4. احتضان الألواح لمدة 1-2 أسابيع حتى تظهر المستعمرات تحت المجهر.
5. لتلطيخ المستعمرات ، اغسلها برفق باستخدام 2-3 مل PBS واحتضانها بمحلول بنفسجي بلوري 2-3 مل (0.1٪ وزن / حجم في 10٪ فورمالين) لمدة 20 دقيقة داخل غطاء زراعة الأنسجة أو غطاء الدخان.
6. قم بإزالة محلول التلوين وغسل الألواح ب 2-3 مل من H₂O ، وقم بإزالة H₂O وألواح التجفيف بالهواء.
7. قم بتحليل النتيجة عن طريق تصور الآبار وعد المستعمرات يدويا بمساعدة قلم تحديد (لتجنب عد نفس المستعمرات مرتين) وتمثيل النسبة المئوية لصلاحية الخلية في الرسم البياني. التقط صورا رقمية للوحات لتمثيل الشكل (الشكل 1).

النتائج

p class = "jove_content" >
الشكل 1: التوصيف الوظيفي والظاهري لنماذج الخلايا المقاومة للدوسيتاكسل. فحوصات تكوين المستعمرة التمثيلية للخلايا الأبوية والخلايا المقاومة للدوسيتاكسيل المعالجة بتركيزات Docetaxel المشار إليها لمدة 72 ساعة. يتم تمثيل النسبة المئوية للمستعمرات لكل تركيز علاج في الرسم البياني المضمن. التجارب ثلاثية النسخ وتمثل البيانات متوسط ± SD. أشرطة المقياس = 5 مم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خلايا DU145 ATCC إتش تي بي-81 22خلايا Rv1 ATCC رقم التعريف الهاتفي-2505 دوسيتاكسيل سيليك للكيماويات S1148 في DMSO (10 مللي متر) 6 ألواح زراعة الأنسجة صقر 353046 RPMI 1640 متوسط جيبكو 11875093 مكمل بنسبة 10٪ FBS و1٪ بنيسيلين/ستربتومايسين كريم الأساس B مصل الأبقار الجنينية الجوزاء 900208 1X محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) كورنينج 21-040 سم كريستال بنفسجي سيجما ألدريتش ج0775 محلول فورمالين 10٪ سيجما ألدريتش HT501128