تلطيخ الفضة الفلورية: تقنية لتصور البروتين الكلي في المواد الهلامية بولي أكريلاميد

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Wong ، A. Y. H. وآخرون. تلطيخ الفضة الفلورية للبروتينات في المواد الهلامية بولي أكريلاميد. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نوضح طريقة تلطيخ الفضة للمواد الهلامية بولي أكريلاميد لتصور البروتين الكلي باستخدام مجسات الفلوروجين.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الجل

1. قم بإجراء SDS-PAGE مع 4٪ - 12٪ من المواد الهلامية البروتينية Bis-Tris (1 مم ، 15 بئر) باستخدام خزان جل صغير مملوء بحمض الإيثان سلفونيك 2- (N-morpholino) (MES).
2. خفف العينات بمزيج من الماء المقطر ، وكبريتات الليثيوم دوديسيل (LDS) ، وعامل تقليل العينة.
3. قم بتحميل الممر الأول بمضاعفة كمية المخزون (10 ميكرولتر) ، متبوعا بكمية المخزون العادية (5 ميكرولتر) وسلسلة من التخفيفات المزدوجة للمخزون بعد ذلك (13 تخفيفا ، من 2x إلى 8192x).
4. قم بتشغيل الجل بجهد ثابت 200 فولت لمدة 30 دقيقة.

< p class = "jove_title" >2. تثبيت الجل

1. بعد الرحلان الكهربائي ، اغمر المواد الهلامية في محلول 100 مل من 40٪ إيثانول / 10٪ حمض الأسيتيك على شاكر مداري عند 50 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة 2x (كل منهما لمدة 30 دقيقة) ، أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
2. اغسل المواد الهلامية 3 × 10 دقائق لكل منها بماء فائق النقاء في وعاء نظيف. خطوة الغسيل أمر بالغ الأهمية. إذا لم تتم إزالة الحمض من محلول التثبيت بشكل صحيح في خطوة التطوير الفلورية ، تنشيط TPE-4TA المفرط بواسطة الحمض ويؤدي إلى مضان قوي في الخلفية في الجل.

فئة

3. تحضير محلول AgNO₃ وتشريب الفضة للهلام

1. لعمل محلول AgNO₃ (0.0001٪) للتشريب ، أولا ، قم بإذابة 0.01 جم من AgNO₃ في 10 مل من الماء عالي النقاء لتحضير محلول مخزون AgNO₃ بنسبة 0.1٪. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول مخزون AgNO₃ بنسبة 0.1٪ إلى 100 مل من الماء عالي النقاء لعمل محلول العمل.
   ملاحظه: يجب تخزين محلول AgNO₃ في الظلام قبل الاستخدام.
2. قم بتشريب الجل ب 100 مل من محلول العمل الفضي لمدة ساعة واحدة على شاكر مداري عند 50 دورة في الدقيقة في وعاء زجاجي محكم الغلق. من الأهمية بمكان إجراء التشريب الفضي تحت غطاء الدخان ، المحمي من الضوء بورق الألمنيوم.
3. اغسل الجل بالماء فائق النقاء (حوالي 100 مل) في وعاء نظيف لمدة 2 × 60 ثانية.

فئة

4. التطور الفلوري للهلام

1. لتحضير محلول مخزون الصبغة (0.1 ملم) ، أضف 3.0 مجم من صبغة TPE-4TA في 50 مل من الماء عالي النقاء. قم بتقطيع المحلول لبضع دقائق وأضف بعض محلول هيدروكسيد الصوديوم (على سبيل المثال 1 م) للمساعدة في إذابة الصبغة.
2. تحقق من تألق المحلول تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر للتأكد من ذوبان جزيء الصبغة بالكامل. تشير المحاليل الضعيفة أو غير الانبعاثية فقط إلى الذوبان الكامل.
   ملاحظه: تم تصنيع الصبغة TPE-4TA وفقا للبروتوكول الذي أبلغ عنه مؤخرا Xie et al.محلول TPE-4TA مستقر للغاية ويمكن الاحتفاظ به في الظلام لعدة أشهر.
3. لتحضير 100 مل من محلول التطوير الفلوري (10 ميكرومتر) ، أضف 10 مل من محلول مخزون TPE-4TA إلى 90 مل من الماء عالي النقاء. تحقق من الرقم الهيدروجيني للمحلول باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني وقم بضبطه على 7-9 باستخدام محلول هيدروكسيد الصوديوم (1 ميكرومتر).
4. انقل الجل إلى وعاء نظيف وقابل للغلق يحتوي على 100 مل من محلول تطوير الفلوروجين. تأكد من أن الجل مغمور تماما في المحلول. أغلق الحاوية. قم بتغطيته من الضوء ورجه طوال الليل على شاكر مداري عند 50 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا تقصير خطوة الحضانة إلى حوالي ~ 2 ساعة عن طريق التسخين المسبق لمحلول تطوير AIE إلى 80 درجة مئوية للتلطيخ ثم تركه في درجة حرارة الغرفة.

< ص الفئة = "jove_title" >5. إزالة البقع والتصوير

1. انقل الجل إلى وعاء نظيف وقم بإزالته في 100 مل من الإيثانول بنسبة 10٪ لمدة 30 ><دقيقة. ملاحظه: يمكن استخدام الماء وحده لغسل الجل. ومع ذلك ، فمن الأفضل من حيث الوقت استخدام محلول الإيثانول بنسبة 10٪ للإزالة من العيوب. سيساعد ذلك على تقليل عملية إزالة البقع من ساعات إلى 30 دقيقة.
2. اشطف الجل بماء فائق النقاء لمدة 5 دقائق.
3. قم بتصوير الجل في قناة 365 نانومتر أو قناة 302 نانومتر بواسطة آلة توثيق الجل.

المواد