< p class = "jove_title" >
1. علاج الجوع لليرقات
ملاحظة: في يرقات الطور الثالث ، هناك عدد قليل من قطرات الدهون التي يمكن اكتشافها أو لا توجد قطرات دهنية يمكن اكتشافها في الخلايا الغريبة في ظل ظروف التغذية العادية ، ولكن يمكن إحداث العديد من قطرات الدهون الكبيرة في الخلايا الكريمة في ظل ظروف الإجهاد ، مثل الجوع. لمزيد من التحقق من هذه الطريقة ، من الضروري المعالجة المسبقة لهذه اليرقات للحث على التكوين الحيوي لقطرات الدهون في الخلايا الكريمة. هنا ، تم اختيار مسار زمني للتجويع من 12 ساعة و 24 ساعة و 36 ساعة كنموذج. على وجه الخصوص ، فترة قصيرة من الجوع (على سبيل المثال ، 3 ساعات) كافية للحث على قطرات دهنية يمكن اكتشافها في الخلايا البيضاء. قد تختلف مدة الجوع وفقا للأهداف والإعدادات التجريبية المحددة.
- اصنع غرفا لعلاجات التجويع والمكافحة.
- بالنسبة لغرف معالجة الجوع: ضع ورق ترشيح بحجم مناسب في طبق بتري مقاس 6 سم وماصة 1 مل من PBS على ورق الترشيح.
- لغرف معالجة التحكم: ضع 5 مل من طعام دقيق الذرة القياسي من بلومنجتون في طبق بتري.
- استخدم ملعقة لحفر الطبقة العليا من الطعام الذي يحتوي على يرقات لا تزال تختبئ في الطعام ونقلها إلى طبق بتري مليء ب 5 مل من PBS. حرك اليرقات برفق في PBS لإزالة أي تلوث غذائي من اليرقات وجعلها نظيفة قدر الإمكان.
- استخدم فرشاة رسم صغيرة لجمع 40 يرقة من الطور الثالث من نفس الحجم التقريبي. قم بفرزها بشكل عشوائي في غرفة تجويع أو تحكم ، مع 20 يرقة لكل منها.
- ضع الغرف في الحاضنة عند 25 درجة مئوية مع رطوبة 60٪ والسماح بالتطوير لمدة 12 ساعة و 24 ساعة و 36 ساعة من العلاج.
ملاحظة: بالنسبة لليرقات الموجودة في غرفة الجوع ، أضف 1 مل من PBS كل 12 ساعة لتجنب جفاف اليرقات.
< p class = "jove_title" >
2. تشريح الخلايا الكريمة
- استخدم فرشاة رسم صغيرة لقطف اليرقات ذات العمر المناسب (12 ساعة أو 24 ساعة أو 36 ساعة بعد العلاج) ، ثم انقلها إلى طبق بتري جديد مليء ب 5 مل من PBS المثلج لغسله.
ملاحظة: كرر الخطوة 2.2 عند التعامل مع اليرقات في غرفة التحكم لإزالة أي تلوث بالطعام.
- املأ لوحة التشريح ب PBS المثلج واستخدم الملقط لنقل اليرقات برفق إلى لوحة التشريح. ضع لوحة التشريح تحت مجهر استريو لخطوة التشريح التالية.
ملاحظة: ستساعد درجة حرارة الجليد الباردة على إبطاء حركات اليرقات وتسهيل التشريح.
- اقلب الجانب البطني لليرقات لأعلى والجانب الظهري لأسفل وثبته برفق في مكانه باستخدام الملقط. قم بتأمين اليرقات في لوحة التشريح عن طريق وضع دبوس تشريح على الرغم من البلعوم في الطرف الأمامي ودبوس آخر من خلال اللولبية في الطرف الخلفي.
ملاحظة: يمكن التعرف على الجانب الظهري بسهولة أكبر من خلال وجود جذوع ظهرية للقصبة الهوائية.
- استخدم مقص زنبركي Vannas للشق (طوليا) عبر البشرة من الأمام إلى النهاية الخلفية.
- قم بإزالة الأنسجة الداخلية للبشرة باستخدام ملقط.
ملاحظة: يجب توخي الحذر عند إزالة فروع القصبة الهوائية لتجنب تلف الخلايا الهوائية ، والتي تكون موضعية في السطح الداخلي للبشرة.
- باستخدام الملقط ، استرجع دبابيس التشريح وانقل البشرة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مملوء ب PBS على الجليد.
- استمر في تشريح اليرقات الأخرى باتباع الإجراء الموضح أعلاه.
فئة
3. تلطيخ قطرات الدهون
- احتضان البشرة المقطعة في مخزن التثبيت لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) على المدور.
ملاحظه: يحتوي المخزن المؤقت للتثبيت على 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS.
- قم بإزالة المخزن المؤقت للتثبيت ، متبوعا بغسل سريع. لإجراء غسيل سريع ، أضف 1 مل من PBS في RT إلى الأنبوب بعد إزالة PFA ، وأعد تعليق الأنسجة برفق ، وتخلص من PBS.
أنذر: يحتوي المخزن المؤقت للتثبيت على PFA ، وهو ضار بصحة الإنسان. من المهم التخلص بشكل صحيح من المخزن المؤقت للتثبيت كنفايات خطرة.
- اغسل العينات 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام PBS لغسل جميع بقايا PFA المحتملة.
- احتضان البشرة باستخدام BODIPY 493/503 (1 ميكروغرام / مل ؛ انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة في RT على دوار.
ملاحظه: من هذه الخطوة فصاعدا ، قم بلف أنبوب الطرد المركزي الدقيق بقطعة من رقائق الألومنيوم لحماية العينات من الضوء وتقليل التبييض الضوئي المحتمل.
- قم بإزالة محلول التلوين BODIPY 493/503 واغسل العينات 3x لمدة 10 دقائق لكل منها باستخدام PBS لإزالة الأصباغ المتبقية تماما.
< p class = "jove_title" >
4. التركيب والتصوير
- ضع 6 ميكرولتر من وسط التركيب على شريحة مجهر نظيفة.
ملاحظه: يتم استخدام وسيط التركيب لوقت كشف أطول بناء على خصائصه المضادة للبهتان.
- استخدم الملقط لالتقاط بشرة واحدة وإزالة PBS المتبقي برفق بمسح.
- ضع البشرة في وسط التثبيت واضبط اتجاهها بحيث يكون سطحها الداخلي الذي يحتوي على الخلايا في الأسفل وسطحها الخارجي في الأعلى.
- ضع غطاء برفق على البشرة.
ملاحظه: قم بإزالة أي وسيط تركيب إضافي يتسرب من أسفل الغطاء بمسحة ، إذا لزم الأمر. لتسهيل التصوير ، ادفع برفق على الغطاء باستخدام ملقط بحيث يمكن تصوير مجموعة الخلايا المثبطة بسهولة في مستوى واحد عند مراقبة الشريحة من خلال المجهر. بدلا من ذلك ، من العملي تقطيع البشرة إلى قسمين من شبه البشرة من خلال الخط الأوسط لتجنب تدحرج البشرة بأكملها عند تركيب الأنسجة.
- ضعي طلاء أظافر شفاف حول حواف الغطاء لإغلاقه.
- ضع الشرائح في صندوق عينة مقاوم للضوء واترك طلاء الأظافر يجف عند RT ، والذي قد يستغرق من 5 إلى 10 دقائق.
- تابع التحليل المجهري. التقط صورا باستخدام مجهر متحد البؤر (تكبير 63x مع إعدادات مرشح GFP أو FITC محسنة، الإثارة = 488 نانومتر، الانبعاث = 503 نانومتر) للحصول على إشارات نظيفة وحساسة بخلفية مصغرة.
