تلطيخ حمض الفوسفاتيز المقاوم للطرطرات: تقنية في المختبر للكشف عن ناقضات العظام المستنبتة المحتوية على إنزيم TRAP

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Dai ، Q. ، et al. A اختبار ثقافة العظم القائم على RANKL لنخاع عظم الفأر للتحقيق في دور mTORC1 في تكوين ناقضات العظم. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تقنية تلطيخ الفوسفاتيز الحمضي المقاوم للطرطرات للكشف عن وجود حبيبات تحتوي على TRAP داخل ناقضات العظم. تشكل هذه التقنية رواسب حبيبات صبغة أرجوانية اللون في سيتوبلازم ناقضات العظم ، مما يجعلها مرئية تحت المجهر المقلوب.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. التحضير

1. توليد فئران حذف رابتور محددة (Raptor^{fl / fl} ؛ Ctsk-cre ، المشار إليها فيما بعد Rap^Ctsk) عن طريق تزاوج الفئران Raptor^{fl / fl} مع فئران Ctsk-cre. استخدم الفئران Raptor^{fl / fl} كعنصر تحكم WT في هذه الدراسة.
2. احصل على وعاء به ثلج للحفاظ على العظام المعزولة.
3. تحضير وسط الثقافة.
   1. قم بإعداد وسط مزرعة α-MEM عن طريق استكمال الحد الأدنى من ألفا المتوسط الأساسي (α-MEM) مع 1x جلوتامين ، بنسلين - ستربتومايسين ، و 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية.
   2. تحضير وسط تحريض البلاعم نخاع العظم يتكون من 50 مل من وسط α-MEM و M-CSF عند 20 نانوغرام / مل.
   3. تحضير وسط تحريض ناقضات العظم يتكون من M-CSF و RANKL عند 20 نانوغرام / مل ، على التوالي ، في 50 مل من وسط α-MEM.
4. قم بإعداد المخازن المؤقتة التالية قبل تلطيخ TRAP.
   1. تحضير محلول الإصلاح الذي يتكون من 6.5 مل من الأسيتون و 2.5 مل من محلول السترات و 0.8 مل من محلول الفورمالديهايد 37٪ (vol / vol).
   2. تحضير محلول تلطيخ TRAP.
      1. قم بتسخين الماء منزوع الأيونات مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
      2. أضف 100 ميكرولتر من محلول قاعدة GBC العقيق السريع و 100 ميكرولتر من محلول نتريت الصوديوم في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل واخلطه عن طريق الانعكاس اللطيف لمدة 30 ثانية.
      3. قم بتسخين 9 مل من الماء منزوع الأيونات إلى 37 درجة مئوية. أضف 200 ميكرولتر من محلول قاعدة العقيق السريع GBC ثنائي الزيزوت من الخطوة 1.4.2.2 ، و 100 ميكرولتر من محلول فوسفات النفثول AS-BI ، و 400 ميكرولتر من محلول الأسيتات ، و 200 ميكرولتر من محلول الطرطرات.
      4. احتفظ بمحلول خليط تلطيخ TRAP في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >2. تشريح (اليوم 1)

1. قتل 3 فئران WT و Rap^Ctsk البالغة من العمر شهرا واحدا بواسطة ثاني أكسيد الكربون₂ بشكل منفصل. إجراء استنشاق ثاني أكسيد الكربون₂ بالمعدات المناسبة من قبل موظفين مدربين.
2. اغمر 6 فئران في دورق يحتوي على 100 مل من 75٪ إيثانول (vol / vol) لمدة 5 دقائق لمنع التلوث البكتيري ثم ضعه على لوح تشريح في وضع ضعيف. قم بعمل شق في الجزء البعيد من الساق عموديا وقم بتشريح الجلد على طول الطرف الخلفي بمقص العيون.
3. قطع الرباط المفصلي لمفصل الورك بالمقص وخلع الأطراف الخلفية من الجذع.
4. قطع الرباط المفصلي لمفصل الركبة وفصل الساق وعظم الفخذ بعناية عن مفصل الركبة. قم بإزالة الأنسجة الرخوة برفق باستخدام المقص.
5. ضع جميع عظام النمط الجيني الواحد في فأر واحد في كل بئر من صفيحة من ستة آبار مع 2 مل من α-MEM على الجليد.
   ملاحظه: للحفاظ على بقاء الخلية ، يجب الاحتفاظ بالعظم في هذه الظروف لمدة تقل عن 1 ساعة.

3. العزل (اليوم 1)

1. املأ بئر واحدة من صفيحة من ستة آبار بنسبة 75٪ إيثانول (3 مل) والآبار الخمسة الأخرى بوسط α-MEM (3 مل).
2. ضع جميع عظام النمط الجيني الواحد في غسل الإيثانول لمدة 15 ثانية واغسل العظام 5 مرات بوسط α-MEM لمدة 10 ثوان في كل مرة.
3. اقطع المشاشية بالمقص وأدخل إبرة حقنة 0.45 مم في تجويف العظام واغسل النخاع بوسط α-MEM في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
4. اغسل تجويف العظام بنفس الطريقة من الطرف الآخر من العظم. كرر مرتين على الأقل لغسل تجويف العظام جيدا حتى يصبح العظم شاحبا.
5. الطرد المركزي نخاع العظم للحصول على حبيبات خلية عند 800 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
6. أضف 3 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء في أنبوب الطرد المركزي والماصة برفق لإعادة تعليق نخاع العظم. احتفظ بأنبوب الطرد المركزي على الجليد لمدة 8 دقائق لتحلل خلايا الدم الحمراء.
7. أضف 6 مل من وسط α-MEM إلى أنبوب الطرد المركزي لوقف تحلل الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق وشفط المادة الطافية.
8. أعد تعليقها في 3 مل من وسط ثقافة α-MEM وضع الخلايا في صفيحة من ستة آبار (بشكل عام فأر واحد لكل بئر).
9. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 5٪ بين} عشية وضحاها.

< ص الفئة = "jove_title" >4. الطلاء (اليوم 0)

1. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل لجمع الخلايا غير المتصلة في صباح اليوم التالي.
2. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وشفط المادة الطافية.
3. أعد التعليق في 4 مل من وسط استزراع α-MEM.
4. خذ 20 ميكرولتر من محلول الخلية واخلطه مع 20 ميكرولتر من Trypan Blue. أضف 10 ميكرولتر من الخليط إلى غرفة العد واحصل على عدد الخلايا لكل مل من المحلول.
5. أضف حجما مناسبا من وسط زراعة α-MEM للحصول على محلول خلوي يبلغ 500,000 خلية / مل.
6. أضف 500 ميكرولتر و 50 ميكرولتر من وسط تحريض البلاعم نخاع العظم في كل بئر من صفيحة 24 بئرا وصفيحة 96 بئرا ، على التوالي.
7. أضف 500 ميكرولتر و 50 ميكرولتر من محلول الخلية في كل بئر من صفيحة 24 بئرا ولوحة 96 بئرا ، على التوالي.
8. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 5٪ لمدة} 3 أيام.

< p class = "jove_title" >5. التمايز (الأيام 3-7)

1. بعد ثلاثة أيام من الطلاء ، اجمع 50 ميكرولتر من الوسط من كل بئر من لوحة 96 بئر وقم بتجميدها عند -20 درجة مئوية ، ثم استنشق الوسط المتبقي.
2. أضف 1 مل و 100 ميكرولتر وسط تحريض ناقضات العظم في كل بئر من صفيحة 24 بئرا وصفيحة 96 بئرا ، على التوالي.
3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة يومين.
4. اجمع 50 ميكرولتر من الوسط من كل بئر واستنشق الوسط المتبقي.
5. أضف وسط تحريض ناقضات العظم في كل بئر.
6. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة يوم واحد
   ملاحظه: في هذه المرحلة الزمنية ، يجب رؤية ناقضات العظم الكبيرة متعددة النوى تحت المجهر المقلوب (الشكل 1 أ).
7. إذا لم تظهر ناقضات العظم ، فقم بتغيير وسيط تحريض ناقضات العظم وراقب يوميا حتى تظهر ناقضات العظم.
8. اجمع 50 ميكرولتر من الوسط من كل بئر من الصفيحة المكونة من 96 بئرا بعد تكوين ناقضات العظم.

فئة

6. تلطيخ فوسفاتيز حمض الطرطرات المقاوم (TRAP)

< p class = "jove_content" >ملاحظة: قد تكون ناقضات العظم الناضجة موجودة بعد 6-7 أيام من الثقافة في المختبر (الخطوة 4).

1. استنشق متوسط واغسله برفق 3 مرات باستخدام 1x PBS.
2. قم بتثبيت الخلايا في كل بئر من الصفيحة المكونة من 96 بئرا ب 100 ميكرولتر من محلول التثبيت لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
3. بعد التثبيت ، قم بسحب محلول التثبيت واغسله برفق 3 مرات بالماء منزوع الأيونات المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
4. أضف 100 ميكرولتر من صبغة TRAP في كل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا وضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وقم بحماية من الضوء.
5. بعد التلوين ، استنشق بقعة TRAP واغسلها برفق 3 مرات بالماء منزوع الأيونات.
6. صور ناقضات العظم باستخدام مجهر مقلوب بتكبير 40X.

النتائج

p class = "jove_content" >
الشكل 1: وجهة نظر تمثيلية لناقضات العظم.(أ) لوحظ ناقضات العظم العملاقة في حقل مشرق في اليوم 6. حدد الخط الأحمر حدود ناقضات العظم. (ب) ناقضات العظم العملاقة ، متعددة النوى ، إيجابية TRAP (النبيذ الأحمر). أشار السهم الأسود إلى نواتين من ناقضات العظم متعددة النوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الفئران Raptorfl / FL مختبر جاكسون 13188 الفئران Ctsk-cre هدية من S. Kato ، جامعة طوكيو ، طوكيو ، اليابان α-MEM كورنينج 10-022-CVR الجلوتامين جيبيكو 25030081 بنسلين ستربتومايسين جيبيكو 15140122 مصل ربلة الساق الجنينية بيو إند 04-001-1 أ بروتين M-CSF المؤتلف للفأر البحث والتطوير س 3U4F9 بروتين RANKL المؤتلف للفأر البحث والتطوير Q3TWY5 مخزن تحلل كرات الدم الحمراء بيوتيم سي 3702 تريبان بلو سيجما ألدريتش 302643 أسيتون شنغهاي للكيماويات المحدودة محلول السترات سيجما ألدريتش 915 محلول الفورمالديهايد شنغهاي للكيماويات المحدودة حمض الفوسفاتيز ، مجموعة الكريات البيض (TRAP) سيجما ألدريتش 387 أ - 1 كيلو طن حل قاعدة العقيق السريع GBC سيجما ألدريتش 3872 محلول نتريت الصوديوم سيجما ألدريتش 914 محلول الفوسفات Naphthol AS-BI سيجما ألدريتش 3871 محلول الأسيتات سيجما ألدريتش 3863 محلول الطرطرات سيجما ألدريتش 3873 محلول ملحي Dulbecco المخزن بالفوسفات كورنينج 21-031-CVR 37٪ فورمالديهايد شيلونغ العلمية IX71 أوليمبوس حقنة 0.45 مم مقص ملقط البعوض