تلطيخ أليزارين الأحمر: تقنية لتصور التمعدن بواسطة بانيات العظم المستنبتة

الملخص

المصدر: Kampleitner, C., et al. ملف تعريف التوافق البيولوجي على المواد الحيوية لتجديد العظام. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تقنية تلطيخ للكشف عن مدى التمعدن أو ترسب الكالسيوم في بانيات العظم الأولية المستزرعة باستخدام صبغة Alizarin Red.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تم تقييم تمعدن العظام (OB) عن طريق تلطيخ Alizarin Red S (ARS)

1. أضف بانيات العظم الأولية (OBs) إلى أقراص فوسفات ثلاثي الكالسيوم β (β-TCP) المستخدمة كسقالة متوافقة حيويا في صفيحة الاستزراع.
2. استنشق وسط الاستزراع من الآبار التي تحتوي على OBs الأولية بعد 14 يوما من إضافة وسط التمعدن واشطفها مرتين ب 0.5 مل من 1x PBS في RT. قم بشفط PBS وإصلاح الخلايا بإضافة 0.5 مل من محلول الفورمالين المخزن بنسبة 10٪ في RT لمدة 10 دقائق.
3. استنشق الفورمالين المخزن بنسبة 10٪ باستخدام ماصة تستخدم مرة واحدة واغسلها مرتين ب 0.5 مل من الماء فائق النقاء.
4. إلى OBs الثابتة ، أضف 0.25 مل من محلول تلطيخ ARS 40 ملي مولار (درجة الحموضة 4.2) المذاب في الماء فائق النقاء واحتضان اللوحة عند RT لمدة 10 دقائق على شاكر بمعدل 100 هزة / دقيقة.
5. قم بشفط محلول التلوين باستخدام ماصة تستخدم مرة واحدة واشطفها ب 1 مل من الماء فائق النقاء. كرر هذه الخطوة من 5 إلى 10 مرات لإزالة البقع غير المحددة.
   ملاحظه: يجب أن يكون محلول الشطف بدون لون.
6. استنشق الماء فائق النقاء وأضف 1 مل من PBS البارد. احتضن الطبق في RT لمدة 10 دقائق على شاكر بمعدل 100 هزة / دقيقة.
7. قم بشفط PBS ، وانقل أقراص β-TCP الملطخة إلى بئر جديد ، وامسح الألواح باستخدام ماسح ضوئي مسطح لتسجيل التمعدن.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أقراص فوسفات ثلاثي الكالسيوم β (β-TCP ، 14 مم) تم تلبيد الأقراص في فرن دثر عند درجة حرارة 1150 درجة مئوية. يمكن العثور على وصف مفصل للإنتاج في Zimmer et al (doi: 10.1002 / jbm.a.34639). تم تشعيع العينات بالأشعة فوق البنفسجية (15 دقيقة لكل جانب) قبل استخدامها في مزارع الخلايا. رغوة أورثوفيتا فيتوس (رغوة β-TCP / C) أورثوفيتا 2102-1405 أليزارين ريد إس سيجما ألدريتش أ 5533 محلول فورمالين محايد مخزن مؤقتا بنسبة 10٪ سيجما ألدريتش HT501128 وسط التمعدن العظمي (مم) α-MEM + 10٪ FBS معطل بالحرارة + 1٪ بنسلين ستربتومايسين + 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك + 5 ملي مولار β-جليسيروفوسفات محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) درجة الحموضة 7.4 جيبكو ، ثيرمو فيشر العلمي 10010023 ماء عالي النقاء: ماء زراعة الخلايا خال من البيروجين VWR L0970-500 عازلة الغسيل أضف 0.05٪ Tween20 إلى 1x PBS. لوحة ثقافة تعليق 24 بئر Greiner bio-one 662102 الماسحة الضوئية المسطحة: Epson Perfection 1200 Photo إبسون ماصة للاستخدام الواحد: ماصة مصل Greiner bio-one 612301 ماء مقطر كارل روث 3478.4 ماصة للاستخدام الواحد: ماصة مصل Greiner bio-one 612301