تلطيخ الفضة للجليكوزامينوجليكان الكبريت: طريقة تلطيخ لتصور الجليكوزامينوجليكان الكبريتات في المواد الهلامية بولي أكريلاميد

الملخص

المصدر: LaRiviere, W. B., et al. الكشف عن الجليكوزامينوجليكان عن طريق الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد وتلوين الفضة. J. Vis. Exp. (2021)

في هذا الفيديو ، نوضح إجراء لتلطيخ الألسيان الأزرق والفضي المشترك لشظايا قليل السكاريد الجليكوزامينوجليكان الكبريتية. تعمل تقنية التلوين المدمجة هذه على تضخيم نطاقات بوليمرات الجليكوزامينوجليكان بأطوال مختلفة في المواد الهلامية بولي أكريلاميد.

البروتوكول

فئة

1. بروتوكول تلطيخ الفضة

1. قم بإعداد جميع الحلول اللازمة لتلوين الفضة مسبقا (الجدول 1).
   ملاحظه: لا تلمس جل PAGE مباشرة حتى يتم تلطيخه وتطويره ووضعه في محلول التوقف. بدلا من ذلك ، قم بمعالجة الجل باستخدام أدوات بلاستيكية أو زجاجية نظيفة. سيؤدي التعامل المباشر مع الجل إلى تشوهات بصمات الأصابع وغيرها من القطع الأثرية المرئية على الجل بعد تلطيخه.
2. بمجرد اكتمال التشغيل ، قم بتفكيك الكاسيت واستخراج الجل في وعاء نظيف متوسط الحجم مملوء بالماء منزوع الأيونات والمرشح.
   ملاحظه: لتجنب التعامل مع الجل مباشرة، استخدم طرف الماصة أو أي شيء بلاستيكي آخر لتقشير الجل برفق بعيدا عن الدرج أثناء غمره في الماء. قد يكون الجل هشا - تعامل معه بعناية.
   1. تخلص من الماء. تلطخ الجل بمحلول تلطيخ أزرق ألسي لمدة 5 دقائق.
   2. تجاهل بقعة ألسيان الزرقاء. اشطف/اغسلها بسرعة 2-3 مرات بالماء منزوع الأيونات المصفى حتى تتم إزالة معظم محلول تلطيخ ألسيان الأزرق.
   3. اتركيه يزيل البقع في الماء منزوع الأيونات والمفلتر طوال الليل على الهزاز. تأكد من وجود كمية كبيرة من المياه المنزوعة الأيونات والمفلترة لضمان غسل أي بقعة متبقية بالكامل من الجل طوال الليل.
   4. اغسل الجل في 50٪ ميثانول (إجمالي 40 دقيقة ، قم بتغيير المحلول 2-3x).
   5. اغسل الجل بالماء منزوع الأيونات والمفلتر لمدة 30 دقيقة. تخلص من الماء وكرر 3 مرات أخرى لمدة 2 ساعة ، واستبدل الماء في كل مرة.
   6. في وعاء جديد ونظيف ، قم بتلطيخ الجل لمدة 30 دقيقة في محلول تلطيخ نترات الفضة.
   7. اشطف/اغسلها بسرعة 2-3 مرات في ماء منزوع الأيونات ومفلتر لإزالة محلول تلطيخ الفضة بالكامل.
   8. يغسل لمدة 30 دقيقة في ماء منزوع الأيونات ومفلتر. تخلص من الماء وكرر 2x لمدة 90 دقيقة ، واستبدل الحمام المائي في كل مرة.
   9. تخلص من الماء وأضف المحلول النامي.
   10. بمجرد إضافة المحلول المطور ، راقب الجل بعناية وراقب ظهور العصابات. اعتمادا على جودة البقعة وكتلة العينة المحملة ، يمكن أن يستغرق التطوير من بضع ثوان إلى عدة دقائق.
   11. بمجرد أن تظهر العصابات المرغوبة ، تخلص على الفور من المحلول المطور واغسله لفترة وجيزة بمحلول التوقف.
   12. تخلص من محلول التوقف وغسله واستبدله بمحلول توقف جديد. اتركيه لينقع لمدة 1 ساعة على هزاز أو شاكر.
   13. يغسل بالماء منزوع الأيونات والمفلتر طوال الليل (ومع ذلك ، يمكن تصوير الجل مباشرة بعد إيقاف غسل المحلول).

الجدول 1: المحاليل المطلوبة لتلوين الفضة للجليكوزامينوجليكان مفصولة عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد. يجب تصفية جميع المحاليل (0.22 ميكرومتر) قبل الاستخدام.

ملاحظة: يجب تصفية جميع المحاليل (0.22 ميكرومتر) قبل الاستخدام. حل وصفة تكوين التعليقات محلول تلطيخ أزرق ألسي (500 مل) مسحوق ألسيان الأزرق 8GX 2.5 جرام التركيز المطلوب: 0.5٪ وزن / حجم 2٪ v / v حمض الخليك الجليدي 500 مل بقعة فضية (200 مل) المياه منزوعة الأيونات 192.7 مل تحضير محلول البقع طازجا ؛ استخدمه في غضون أسبوع واحد. 7.6 مليون هيدروكسيد الصوديوم 2 مل لتحضير, أضف 3.04 جرام كريات هيدروكسيد الصوديوم إلى 10 مل من الماء هيدروكسيد الأمونيوم 3.3 مل محلول نترات الفضة 4M 2 مل لتحضيرها ، أضف 3.397 جم من نترات الفضة إلى 5 مل من الماء. أضف قطريا مع التحريك لتجنب هطول الأمطار. تطوير الحل (501 مل) المياه منزوعة الأيونات 500 مل يجب أن يكون المحلول المطور طازجا ويستخدم في غضون 24 ساعة. 2.5٪ وزن / حجم حامض الستريك 1 مل لتحضيرها ، أضف 100 مجم إلى 4 مل من الماء منزوع الأيونات. يجب أن يكون حامض الستريك طازجا. فورمالدهيد 250 ميكرولتر stop solution (500 مل) المياه منزوعة الأيونات 300 مل حمض الخليك الجليدي 20 مل ميثانول 90 مل

المواد