تلطيخ Giemsa لمقايسة تكوين المستعمرة: إجراء تلطيخ في المختبر لتقييم القدرة التكاثرية للخلايا الجذعية الوسيطة

الملخص

المصدر: Schlaefli ، P. et al. طريقة إنزيمية لإنقاذ الخلايا الجذعية الوسيطة من عينات نخاع العظام المتخثرة. J. Vis. Exp. (2015)

في هذا الفيديو ، نوضح إجراء تلطيخ Giemsa لتقييم الإمكانات التكاثرية للخلايا الجذعية الوسيطة لتشكيل مستعمرات قابلة للحياة. صبغة Giemsa هي صبغة محايدة تتكون بشكل أساسي من أصباغ اللازوردية واليوزين ، والتي تحمل تقاربا انتقائيا للمكونات الخلوية اعتمادا على شحنتها.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. البذر لزراعة الخلايا المتمدد وألواح CFU

1. أعد تعليق الخلايا (التي تتكون من كريات الدم الحمراء والخلايا أحادية النواة) في 50 مل من الوسط القاعدي: Alpha-MEM مكمل بمصل الأبقار الجنيني 10٪ (FBS) ، 100 واحد / مل بنسلين ، 100 مجم / مل ستربتومايسين و 2.5 مجم / مل أمفوتريسين B. عد الخلايا المخففة بنسبة 1:10 في محلول Trypan Blue باستخدام حجرة Neubauer.
2. قم بوضع الخلايا في قوارير زراعة الخلايا بكثافة 5 × 10 خلايا / سم² واحتضانها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية. إذا كان ذلك متاحا ، استخدم ظروف نقص الأكسجين (5٪ أكسجين). للتحكم في فحص CFU ، قم بوضع 10⁹ خلايا في طبق ثقافة خلية بقطر 10 سم.
3. بعد 3 أيام من الثقافة ، يتم ربط الخلايا الجذعية الوسيطة بطبق زراعة الخلايا بينما تظل الخلايا الأخرى معلقة. قم بتغيير الوسائط بوسط قاعدي مكمل بعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي 5 نانوغرام / مل (bFGF). للتحكم في فحص CFU ، تعامل مع طبق زراعة الخلية بالمثل.
4. استمر في زراعة الخلايا لمدة أسبوعين ، وتبادل الوسائط ثلاث مرات في الأسبوع. إذا تجاوزت الخلايا 80٪ من التقاء، فقم بتقسيمها عن طريق التربسين. بالنسبة للتحكم في فحص CFU ، قم بتبادل الوسائط بالمثل ، ولكن لا تقم بتقسيم الخلايا على مدار الأسبوعين.

< p class = "jove_title" >2. Giemsa Stain لفحص CFU

1. تحضير 10 مل من محلول Giemsa لكل طبق: قم بتخفيف محلول المرق (7.6 جم / لتر Giemsa في الجلسرين: الميثانول) 1:10 في ماء معقم (قم دائما بإعداد مخفف عمل طازج).
2. قم بإزالة الوسائط من طبق زراعة الخلايا وغسل الخلايا باستخدام PBS. كن حذرا جدا عند وضع السائل على طبق بتري وتجنب غسل الخلايا.
3. قم بإصلاح الخلايا في الميثانول النقي لمدة 5 دقائق في RT. تخلص من الميثانول. أضف محلول Giemsa واحتضنه لمدة 60 دقيقة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية.
4. يغسل مرتين باستخدام PBS. جفف رأس اللوحة بالهواء أولا على منشفة ورقية. عد المستعمرات يدويا. من الأفضل تحقيق ذلك باستخدام قلم تحديد على الجزء الخلفي من اللوحة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات المكونات المتوسطة القاعدية PenStrep 100X جيبكو 15140122 FGF البشري الأساسي بيبروتك 100-18 ب MEM Alpha ث / نيوكليوزيد ، ث / جلوتامين مستقر أميد 1-23S50-I FBS الحرارة معطلة أميد 2-01F36-I الأمفوتريسين ب أبليشم أ 1907 العامه برنامج تلفزيوني أبليشم 964.91 دولار صبغة جيمسا أبليشم أ 0885 المواد الاستهلاكيه طبق خلية بريماريا صقر 353803 قارورة زراعة الخلية - قارورة T300 برنامج النقاط التجارية 90301 معدات ماصة Stripettes Serological 5 مل كورنينج 4487-200 م حاضنة مرطب Heracells 240 حراري علمي 51026331 هيريوس Multifuge 1S-R حراري علمي 75004331