تلطيخ ألسيان الأزرق لتصور البروتيوغليكانات: تقنية للكشف عن البروتيوغليكان في الخلايا الجذعية الوسيطة المتمايزة بالخلايا الغضروفية المتمايزة في المختبر

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Schlaefli ، P. et al. ، طريقة إنزيمية لإنقاذ الخلايا الجذعية الوسيطة من عينات نخاع العظم المتخثر. J. Vis. Exp. (2015).

يصف هذا الفيديو إجراء تلطيخ الألسيا الأزرق لتحديد موقع البروتيوغليكان الذي تفرزه الخلايا الغضروفية الوظيفية. تساعد هذه الطريقة في تحديد نجاح التمايز في المختبر للخلايا الجذعية الوسيطة إلى خلايا غضروفية ناضجة.

البروتوكول

ملاحظة: تم جمع نشفط نخاع عظم من القمة الحرقفية بموافقة مالك. تم مقاومة شفط نخاع العظم للكلاب (حوالي 10 مل) عن طريق إضافة 15 مل من سترات الصوديوم 3.8٪ مباشرة بعد الانسحاب في غرفة العمليات. ونقلت العينات إلى بيئة المختبر لمعالجتها في نفس اليوم الذي تم سحبها فيه.

< p class = "jove_title" >1. تحضير Urokinase (قبل الاستخدام 1

)

1. أعد تكوين اليوروكيناز باستخدام محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة: أضف 10 مل من PBS إلى قارورة مدخل الحاجز باستخدام حقنة سعة 10 مل. قم بإذابة المادة الجافة عن طريق التدوير للحصول على 50,000 وحدة حقن (U) لكل مل.
2. قم بإعداد 500 ميكرولتر من الحصص (25,000 وحدة لكل منهما) في أنابيب معقمة. قم بتخزين الكميات -20 درجة مئوية واستخدمها عند الحاجة لمدة 6 أشهر على الأقل.

< p class = "jove_title" >2. الخطوات التحضيرية (قبل كل علاج لنخاع العظم)

1. قم بإذابة كمية واحدة من اليوروكيناز (25,000 U) لكل شفط نخاع عظمي متخثر (تم علاج أحجام الشفط التي تصل إلى 25 مل بنجاح باستخدام كمية واحدة من 25,000 U).
2. سخن حمام مائي أو حاضنة رج إلى 37 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >3. الملخص الأنزيمي للجلطة

1. قم بأداء جميع الأعمال في خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الرقائقي لتجنب التلوث الميكروبي لعينات نخاع العظام أثناء المعالجة. عند العمل مع مواد بشرية يحتمل أن تكون معدية ، ينصح باستخدام القفازات الواقية ، وكذلك التعامل بعناية.
2. ضع مصفاة خلية 100 ميكرومتر فوق أنبوب معقم سعة 50 مل. اسكب نخاع العظم بعناية من خلال مصفاة الخلية ، أو قم بإمالة المصفاة أو التحرك حول مادة الجلطة. استخدم طرف ماصة معقم لتحسين التدفق عبر شبكة المرشح.
   ملاحظه: تجنب أي تخفيف للجلطة ، على سبيل المثال ، عن طريق غسل الجلطة باستخدام PBS. يعمل Urokinase بشكل غير مباشر ويتطلب مكونات من المصل (أي البلازمينوجين) من الخزعة للهضم الفعال. أثناء الاستمرار في الإجراء مع مادة الجلطة ، يمكن الاحتفاظ بالمرشح في RT حتى الاستخدام الإضافي في الخطوة 3.6.
3. انقل مادة جلطة نخاع العظم إلى طبق زراعة خلية فارغ باستخدام ملقط معقم. قطع الحطام إلى قطع صغيرة حوالي 2 مم³ باستخدام مشرط معقم.
4. انقل القطع الصغيرة من الجلطة إلى أنبوب تفاعل سعة 50 مل باستخدام ملقط معقم. تأكد من أن الجلطة المفرومة لها مظهر رطب. إذا بدا أنه جاف ، استخدم بعضا من المرشح من الخطوة 3.1 للترطيب.
5. قم بإخراج الجلطة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل لمدة 5 مرات باستخدام ماصة ميكروتيتر سعة 5 مل. أضف 1 كمية من اليوروكيناز إلى العينة. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية إما في حمام مائي أو في حاضنة تهتز (برفق).
6. قم بثلاثية عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل لمدة 5 مرات باستخدام ماصة سعة 5 مل. قم بتنفيذ هذه الخطوة في خزانة السلامة البيولوجية. احتضن لمدة 30 دقيقة أخرى عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بثلاثية الأبعاد مرة أخرى 5 مرات باستخدام ماصة سعة 5 مل. مرر مصفاة خلية جديدة 100 ميكرومتر لتتجمع مع المرشح من الخطوة 3.2.
7. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية في درجة الحرارة المحيطة لمدة 10 دقائق عند 500 × جم. أعد تعليق حبيبات الخلية في الوسائط كما هو موضح أدناه أو وفقا للإجراء القياسي للمختبر الخاص بك لثقافة التوسع MSC.

فئة

4. البذر لزراعة الخلايا التمددية وألواح CFU

1. أعد تعليق الخلايا (التي تتكون من كريات الدم الحمراء والخلايا أحادية النواة) في 50 مل من الوسط القاعدي: Alpha-MEM مكمل بمصل الأبقار الجنيني 10٪ (FBS) ، 100 واحد / مل بنسلين ، 100 مجم / مل ستربتومايسين و 2.5 مجم / مل أمفوتريسين B. عد الخلايا المخففة بنسبة 1:10 في محلول Trypan Blue باستخدام حجرة Neubauer.
قم
2. بلوحة الخلايا في قوارير زراعة الخلايا بكثافة 5 × 10⁷ خلايا / سم² واحتضانها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية. إذا كان ذلك متاحا ، استخدم ظروف نقص الأكسجين (5٪ أكسجين). للتحكم في فحص CFU ، لوحة 10⁹ خلايا في طبق ثقافة خلية بقطر 10 سم.
3. بعد 3 أيام من الثقافة ، يتم ربط الخلايا الجذعية الوسيطة بطبق زراعة الخلايا بينما تظل الخلايا الأخرى معلقة. قم بتغيير الوسائط بوسط قاعدي مكمل بعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي 5 نانوغرام / مل (bFGF). للتحكم في فحص CFU ، تعامل مع طبق زراعة الخلية بالمثل.
4. استمر في زراعة الخلايا لمدة أسبوعين ، وتبادل الوسائط ثلاث مرات في الأسبوع. إذا تجاوزت الخلايا 80٪ من التقاء، فقم بتقسيمها عن طريق التربسين. بالنسبة للتحكم في فحص CFU ، قم بتبادل الوسائط بالمثل ، ولكن لا تقم بتقسيم الخلايا على مدار الأسبوعين.

5. تمايز MSC

1. تمايز الخلايا الجذعية الجذعية للكلاب
   ملاحظه: تم تمييز الخلايا الجذعية الجذعية للكلاب إلى سلالات غضروفية وعظمية وشحمية عن طريق التحفيز بالوسائط المناسبة لمدة أربعة أسابيع.
2. التمايز الغضروفي
   1. قطع مكعبات (3 مم لكل جانب) من جهاز طبي على شكل إسفنجة ، يتكون من الكولاجين المجفف بالتجميد من النوع الأول ، ويستخدم كمادة سقالة لدعم الخلايا.
   بذور
   2. الخلايا الجذعية الجذعية في الجزء العلوي من المكعبات بتركيز 4 × 10⁶ خلايا / مل (~ 70,000 خلية / مكعب).
   3. قبل إضافة الوسائط ، اسمح للخلايا بالالتصاق بالمكعبات لمدة 30 دقيقة.
   4. الحفاظ على تركيبات MSC-collagen في الوسائط الغضروفية المكونة من DMEM/F12 + GlutaMAX، 2.5٪ FBS، 100 وحدة/مل بنسلين، 100 ملغم/مل ستربتومايسين، 2.5 ميكروغرام/مل أمفوتريسين ب، 40 نانوغرام/مل ديكساميثازون، 50 ميكروغرام/مل حمض الأسكوربيك 2-فوسفات، 50 ميكروغرام/مل ل-برولين، 1x الأنسولين-ترانسفيرين-سيلينيوم X، و 10 نانوغرام/مل عامل النمو المحول β1.
   5. استخدم تلطيخ الألسيا الأزرق لتصور تراكم البروتيوغليكان في أقسام البناء. باختصار ، قم بتلطيخ الأقسام O / N مع 0.4٪ أزرق ألكيان مذاب في 0.01٪ H₂SO₄ و 0.5M غوانيدين هيدروكلوريد. بعد ذلك ، تم غسل الأقسام لمدة 30 دقيقة في 40٪ DMSO و 0.05M MgCl₂. تم تلطيخ الخلايا باللون الأحمر النووي السريع.

المواد