تلطيخ السودان الرابع: إجراء تلطيخ لويحات تصلب الشرايين المحملة بالدهون في قوس الأبهر المحصود للفأر

الملخص

المصدر: Centa, M., et al. القياس الكمي لتصلب الشرايين في الفئران. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو إجراء باستخدام صبغة السودان IV لتلطيخ الرواسب الدهنية في قوس الشريان الأبهري للفأر المحصود لتصور لويحات تصلب الشرايين وتحديد مدى تصلب الشرايين.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحليل الوجه للقوس الأبهري والشريان العضدي الرأسي

1. إعداد أسرة التثبيت لتحليل الأقواس الأبهري. قم بطي جزء من فيلم شمع البارافين ثماني مرات لعمل سطح مسطح 25 مم × 25 مم. لفها بشريط عازل كهربائي أسود لعمل خلفية داكنة للشريان الأورطي. ضع ملصقا على الجانب الخلفي من سرير التثبيت واستخدم قلم رصاص لكتابة رقم تعريف الماوس (سيختفي حبر القلم العادي في عملية التلوين).
2. انقل القوس الأبهري إلى سرير التثبيت وضع قطرة من PBS فوقه. ابدأ في تنظيف الشريان الأورطي من الأنسجة الدهنية المتبقية حول الولادة تحت مجهر مجسم.
   1. استخدم مقص Vannas وملقط Dumont لتقشير جميع الأنسجة الدهنية المحيطة بلطف دون التلاعب بالشريان الأورطي أو إتلافه. سوف يلطخ السودان IV الأنسجة الدهنية بشكل مشرق ومن الضروري إزالة كل هذه الأنسجة في هذه المرحلة.
      ملاحظه: حافظ على رطوبة الشريان الأورطي في جميع الأوقات مع تطبيق PBS إضافي عند الحاجة.
3. اقطع الشريان الأورطي في المستوى الإكليلي عن طريق إدخال مقص Vannas في تجويف الأبهر لفضح السطح الحمي. ابدأ في قطع الانحناء الخارجي للقوس الصاعد في الاتجاه البعيد واستمر في قطع الفروع بما في ذلك الشريان العضدي الرأسي. تجنيب الجزء الظهري من المنطقة الصدرية الهابطة.
   1. اقطع الانحناء الأصغر وقم بطي الشريان الأورطي لعرض السطح الداخلي.
      ملاحظه: تتطلب هذه الخطوة مهارات حركية دقيقة وتحتاج إلى بعض الممارسة لإتقانها.
4. قم بتثبيت القوس المفتوح على سرير التثبيت باستخدام الطرف الحاد لدبابيس الحشرات الدقيقة. استخدم حامل إبرة Castroviejo صغير لوضع المسامير في مكانها. ثني المسامير برفق بعيدا عن العينة عندما تكون في مكانها. قم بتثبيت الشريان الأورطي بشكل مسطح على السرير دون تمديد العينة. قم بتخزين القوس المثبت متجها لأسفل في طبق بتري مليء ب PBS عند 4 درجات مئوية
   ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
5. إعداد حل عملي للسودان الرابع. اخلطي 1 جم من مسحوق السودان الوريدي ، و 100 مل من 70٪ إيثانول ، و 100 مل من الأسيتون في زجاجة داكنة وقلبي برفق لمدة 10 دقائق. ليست هناك حاجة لتصفية المحلول ويمكن استخدامه لبضعة أشهر إذا ظل مظلما في درجة حرارة الغرفة. إذا كان لون التلوين غير مرض ، فيمكن عمل حل جديد وتلطيخ العينات مرة أخرى.
   أنذر: الأسيتون هو سائل قابل للاشتعال يمكن أن يسبب تهيجا خطيرا للعين. تخزينها في مكان جيد التهوية واتخذ الإجراءات الاحترازية عند المناولة.
6. رتب خمسة أطباق بتري على مقعد المختبر: واحد محشو ب 70٪ إيثانول ، وواحد محشو بمحلول عمل السودان الرابع ، واثنان مملوءان ب 80٪ إيثانول ، وواحد مليء ب PBS.
   1. ابدأ بشطف العينة في 70٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق عن طريق وضع طبقة التثبيت في طبق بتري الأول بحيث يكون القوس متجها لأسفل. انقل العينة إلى محلول عمل السودان الرابع واتركها تلطخ القوس لمدة 7 دقائق.
   2. بعد ذلك ، اشطف بنسبة 80٪ من الإيثانول لمدة 3 دقائق مرتين لإزالة السطح الحميمي الطبيعي. يمكن تعديل وقت الإلغاء لتحسين النتائج. أخيرا ، اشطفها في PBS قبل إعادة العينة إلى طبق بتري الأصلي.
7. احصل على صور مجهرية باستخدام مجهر مجسمة بتكبير 10 مرات متصل بكاميرا رقمية. التقط صورا للقوس المثبت المغمور في PBS باستخدام أوزان معدنية صغيرة (20 مم × 10 مم × 5 مم) لتثبيت سرير التثبيت في قاع طبق بتري.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات شريط عازل كهربائي أسود (بعرض 50 مم) أي بائع تجزئة متخصص لإنشاء أسرة تثبيت للأقواس الأبهري. مقص تشريح (10 سم ، مستقيم) أدوات الدقة العالمية 14393 للتشريح العام للأعضاء. ملقط دومون # 5 (11 سم ، مستقيم) أدوات الدقة العالمية 500341 للتشريح المجهري للشريان الأورطي. الإيثانول 70٪ (حجم / حجم) كيماويات VWR 83801.29 سائل وبخار شديد الاشتعال ، يحفظ في مكان جيد التهوية ويحافظ على البرودة. الإيثانول المطلق ≥99.8٪ كيماويات VWR 20821.31 سائل وبخار شديد الاشتعال ، يحفظ في مكان جيد التهوية ويحافظ على البرودة. الفورمالديهايد 4٪ مستقر ، مخزن مؤقت (درجة الحموضة 7.0) كيماويات VWR 9713.1 ضار بالاستنشاق ، عند ملامسته للجلد وفي حالة ابتلاعه. إيزوبوبانول ميرك 1096341011 سائل قابل للاشتعال ، يسبب تهيجا خطيرا للعين ، وقد يسبب النعاس أو الدوخة. حامل إبرة Micro Castroviejo (9 سم ، مستقيم) أدوات الدقة العالمية 503376 لتثبيت الأقواس الأبهري. دبابيس الحشرات Minutien ، 0.10 مم أدوات العلوم الدقيقة 26002-10 لتثبيت الأقواس الأبهري. بارافيلم م بيميس PM992 يستخدم فيلم شمع البارافين لإنشاء أسرة تثبيت للأقواس الأبهري. محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) - - مطلوب محلول معقم وخالي من RNase لتروية الفئران مجهر مجسمة لايكا مايكروسيستمز ميز6 للتشريح والتوثيق السودان الرابع سيجما ألدريتش إس 4261 لا تصنف على أنها مادة أو خليط خطير. مقص فاناس (8 سم ، مستقيم) أدوات الدقة العالمية 503378 للتشريح المجهري للشريان الأورطي.