< p class = "jove_title" >1. تضمين الجذع
- اصنع محلول الاغاروز بنسبة 7٪ في الماء (7 جم من الاغاروز بدرجة الرحلان الكهربائي في 100 مل من الماء المقطر). قم بإذابة الاغاروز عن طريق التعقيم لمدة 20 دقيقة أو عن طريق الميكروويف لمدة 20 دقيقة بأقل كثافة (على سبيل المثال ، كثافة 10٪ من ميكروويف 1،250 واط).
- قم بإعداد قالب محلي الصنع لتضمين السيقان باستخدام قوارير بلاستيكية.
- باستخدام شفرة حلاقة ، قم بقطع الجزء السفلي المخروطي لأنبوب الطرد المركزي الدقيق ذو الغطاء اللولبي سعة 2 مل (الجزء أ). باستخدام إبرة حقنة ، قم بثقب ثقب في غطاء الأنبوب أكبر قليلا من قطر الجذع المراد تضمينه. بعد ذلك ، قم بقطع 0.5 سم من قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق 0.6 مل (الجزء ب).
- أضف الجزء المقطوع 0.5 سم من أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 0.6 مل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المقطوع مسبقا 2 مل. أغلق الجزأين باستخدام Parafilm (الشكل 1).
ملاحظه: يتم قطع الجزء السفلي من الأنبوب لتسهيل إزالة العينة المضمنة بعد تصلب الاغاروز. سيساعد الثقب الموجود في الغطاء في تثبيت الجذع عندما يكون الجذع جزءا لا يتجزأ من الاغاروز. سيعمل القالب على تثبيت الاغاروز وإمساك الجذع بشكل مستقيم عند التضمين. سيحتفظ البارافيلم بالجزأين ، A و B ، حتى يتم تثبيت الاغاروز وتضمين الساق.
- باستخدام شفرة حلاقة ، قم بقص قسم جذعي من منطقة الاهتمام ، (على سبيل المثال منتصف الجزء الداخلي من الجذع الأول).
ملاحظه: من الناحية المثالية ، يجب قطع الجذع قبل التضمين مباشرة لتجنب التدمير بسبب الجفاف. بدلا من ذلك ، يمكن تخزين الجذع مؤقتا في صفيحة تحتوي على ورق ترشيح مبلل بالماء. يمكن وضع هذه اللوحة على الجليد حتى تصبح جاهزة للانحناء لمنع جفاف الأنسجة وتشوهها. سيؤدي تخزين الجذع لفترات أطول من 30 دقيقة بدون رطوبة عالية إلى جفاف الساق.
- قم بإذابة الاغاروز في الميكروويف بكثافة منخفضة.
أنذر: قد تكون الزجاجة التي تحتوي على الاغاروز ساخنة. استخدم قفاز لالتقاط الزجاجة. دع الاغاروز المذاب يقف في درجة حرارة الغرفة (بين 20 درجة مئوية و 25 درجة مئوية) حتى يبرد إلى حوالي 50 درجة مئوية.
- ضع الماصة ببطء 5 مل من الاغاروز في القالب البلاستيكي الجاهز لملء القارورة.
ملاحظه: تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في القوالب. ستسبب فقاعات الهواء فجوات في قالب الاغاروز ولن تغطي عينة الساق بالكامل ، مما سيؤدي في النهاية إلى قطع غير متساو لأقسام العينة.
- دع الاغاروز يبرد لمدة 30 إلى 60 ثانية ليصبح شبه صلب. اختبر باستخدام عود أسنان صغير ، وتأكد من أنه يمكن أن يخترق ويقف ، ولكن لا يطفو ، في الاغاروز.
ملاحظه: إذا تم وضع الجذع عندما لا يزال الاغاروز ساخنا ، فسوف يتلف العينة عن طريق ذبول الجذع ، مما يؤدي إلى تدمير مورفولوجيا الخلية.
- ضع الجذع في هذه القارورة المليئة بالأغروز. تأكد من بقاء الجذع مستقيما. ضع الغطاء المثقوب بحيث يتم تثبيت طرف الساق بواسطة الغطاء. لا تقم بتشغيل الغطاء اللولبي. في وقت ما يمكن تضمين أكثر من جذع واحد (من نوع واحد) في قارورة واحدة. لكن في هذه الحالة ، لا تستخدم CAP.
ملاحظه: إذا تم تدوير الغطاء اللولبي ، فسوف يلتف الجذع.
- اترك القارورة في درجة حرارة الغرفة أو عند 4 درجات مئوية لمدة 10-30 دقيقة ، حتى تتماسك.
- قم بإزالة القالب عن طريق تحريكه برفق خارج الأنبوب. افتح Parafilm. ادفع الجزء السفلي من الجزء ب من القالب برفق بالإبهام لتحرير الاغاروز المتصلب من الجزء أ على شريحة مجهر زجاجي.
- قطع جذع الاغاروز المدمج إلى ثلاث قطع متساوية تقريبا بطول 1.2 سم. اقطع جزء الجذع الذي لم يكن في الاغاروز وتخلص منه.
- قم بتخزين هذه القطع من الاغاروز مع السيقان المدمجة في أنابيب طرد مركزي دقيقة محكمة الإغلاق سعة 2 مل في صندوق مظلم عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للتقسيم. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الأنابيب عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد كحد أقصى.
ملاحظه: التخزين ممكن ، لكن المجرب يحتاج إلى أن يدرك أن السيقان المضمنة لا تزال على قيد الحياة ، واعتمادا على التجربة ، يمكن إدخال القطع الأثرية.
< p class = "jove_title" >2. تقسيم الجذع
تنبيه: اقرأ دليل الاهتزاز بعناية واتبع جميع تعليمات السلامة.
- تأكد من أن قرص العينة نظيف وجاف تماما (خال من أي مادة صلبة أو سائلة). نظف قرص العينة بشفرة حلاقة لإزالة أي غراء متبقي من التجارب السابقة واغسله بالماء. ثم جفف بمنشفة ورقية.
ملاحظه: سيضمن ذلك أن المادة اللاصقة تعمل بشكل جيد وترتبط بعينة الاغاروز. إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة بشكل صحيح ، فمن المحتمل ألا تلتصق العينة بالقرص وستتسبب لاحقا في سقوط العينة من القرص أثناء التقسيم.
- استخدم مناديل ورقية ناعمة لإزالة أي رطوبة من كتلة الاغاروز التي تحتوي على العينات.
- ضع قطرة صغيرة من لاصق المناديل على قرص العينة. قم بإخراج المادة اللاصقة لتغطية المنطقة الموجودة في منتصف اللوحة باستخدام طرف الزجاجة اللاصقة. ضع كتلة الاغاروز بسرعة بحيث تكون العينات إما متعامدة مع اللوحة أو بالتوازي معها للمقاطع العرضية أو الطولية ، على التوالي. اسمح للمادة اللاصقة بتثبيت العينة على قرص العينة في درجة حرارة الغرفة أو عند 4 درجات مئوية لمدة 10-30 دقيقة. ملاحظة: هذه خطوة حساسة للوقت.
- ثبت قرص العينة في مكانه على الدرج المؤقت أو الحوض الصغير. يجب أن تكون كتلة / كتل الاغاروز مع الأقسام موازية لشفرة الحلاقة. املأ الدرج العازل بالماء المقطر في درجة حرارة الغرفة حتى تغمر العينات بالكامل.
- اقطع شفرة الحلاقة إلى نصفين ثم قم بقص الأطراف بمقص قوي حتى تظل الشفرة مسطحة تماما. قم بتوصيل نصف شفرة الحلاقة المقطوعة مسبقا بحامل السكين.
- اضبط الزاوية على حامل السكين على 84 درجة ، والسرعة على 0.90 مم / ثانية (الموضع 8 على الاهتزاز) والتردد على 50 هرتز (الموضع 5 على الاهتزاز). قطع أقسام بسمك 100 ميكرومتر. استخدم الوضع المستمر. ملاحظه: تم اختيار هذا السماكة للتأكد من أن الأنسجة يمكن أن تتحمل المعالجات الحمضية والقاعدية المختلفة المستخدمة في بعض بروتوكولات التلوين. اضبط النافذة للتقسيم واترك 15-20 دقيقة في الوضع المستمر للاهتزاز لتقسيم كتلة الاغاروز التي يبلغ طولها حوالي 1.2 سم.
- اجمع الأقسام باستخدام ماصة بلاستيكية يمكن التخلص منها أثناء التقسيم في الدرج المؤقت. بدلا من ذلك ، يمكن نقل الأقسام من الدرج العازل إلى دورق زجاجي ثم إلى لوحة بتري شفافة. انقل بعض الأقسام إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 2.0 مل. ملاحظة: يتم جمع العينات من لوحة بتري لأنه من الأسهل رؤية الأقسام على خلفية واضحة ، ولأنه يمكن تحضير صينية المخزن المؤقت للعينة التالية.
- يمكن تخزين الأقسام في أنبوب سعة 50 مل أو جمعها وتخزينها في أنابيب طرد مركزي دقيقة من 1.5 إلى 2 مل عند 4 درجات مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة < / >
ملاحظه: سيؤدي تخزين الأقسام لفترات أطول إلى ضعف جودة الصورة.
< p class = "jove_title" >3. تلطيخ Phloroglucinol-HCl (Wiesner)
- قم بإذابة 0.3 جم من الفلوروجلوسينول في 10 مل من الإيثانول المطلق لتحضير محلول الفلوروجلوسينول بنسبة 3٪. امزج حجما واحدا من حمض الهيدروكلوريك المركز (37 نيوتن) إلى مجلدين من 3٪ من الفلوروجلوسينول في الإيثانول ؛ هذا المحلول هو phloroglucinol-HCl (Ph-HCl) أو صبغة Wiesner.
ملاحظه: يجب أن يكون هذا المحلول طازجا في يوم التلوين ولا يمكن تخزينه ، لأن المحلول سوف يتحلل بمرور الوقت وسيصبح التلوين غير فعال.
أنذر: حمض الهيدروكلوريك شديد التآكل ، لذا توخي الحذر الشديد أثناء التعامل مع بقعة Ph-HCl.
- انقل أقسام الساق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2.0 مل. أضف 1 مل من محلول Ph-HCl إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأقسام وقم بتغطيته على الفور لأن حمض الهيدروكلوريك في صبغة Ph-HCl شديد التآكل. حرك الأنبوب برفق للتأكد من أن جميع الأقسام ملطخة. بديل لهذه الخطوة هو إبقاء غطاء الأنبوب مفتوحا بحيث يمكن سحب محلول Ph-HCl لأعلى ولأسفل ، ويفضل أن يكون ذلك دون إزعاج الأقسام.
ملاحظه: احرص على عدم إدخال الماصة في طرف الماصة، لأن ذلك قد يؤدي إلى إتلاف تلك الأقسام.
- استخدم ماصة سعة 1 مل مع قطع طرف الماصة بحيث يمكن سحب الأقسام بسهولة دون تلف. ضع أقسام الماصة برفق في الطرف وعلى شريحة المجهر. قم بتغطية الأقسام بقلة الغطاء. راقب الأقسام الموجودة تحت إضاءة المجال الساطع. (الشكل 2)
ملاحظه: يجف محلول Ph-HCl في غضون 5-10 دقائق ، مما يتسبب في تدهور العينات. لذلك ، يجب إكمال التصوير خلال تلك الفترة الزمنية.
