تلطيخ اللول للجنين: تقنية لتوصيف توزيع اللجنين في أقسام ساق أرابيدوبسيس ثاليانا

الملخص

المصدر: Pradhan Mitra، P. et al.، تلطيخ الكيمياء النسيجية لعناصر جدار الخلية الثانوية لأرابيدوبسيس ثاليانا. J. Vis. Exp. (2014).

في هذا الفيديو ، نصف تقنية تلطيخ Maule لتلوين لجنين الحقن الموجود في الخلايا النباتية المتخصصة. تساعد تقنية التلوين هذه على توصيف توزيع اللجنين في نسيج الخشب والألياف بين اللفافة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تلطيخ Mäule

1. قم بإذابة 0.2 جم من برمنجنات البوتاسيوم في 40 مل من الماء المقطر لتحضير محلول برمنجنات البوتاسيوم بنسبة 0.5٪. يحفظ في زجاجة داكنة في درجة حرارة الغرفة لمدة أقصاها 7 أيام.
   1. تحضير محلول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 3.7٪ عن طريق إضافة 1 مل من حمض الهيدروكلوريك المركز (37 نيوتن) إلى 9 مل من الماء المقطر (1:10). قم بإعداد محلول حمض الهيدروكلوريك الطازج بنسبة 3.7٪ في يوم التجربة. تأكد من أن محلول مخزون 37 N HCl المستخدم ليس قديما جدا. يجب تخزين محلول هيدروكسيد الأمونيوم المركز (14.8 م) عند 4 درجات مئوية لمنع انخفاض مولارية المحلول المشبع.
2. انقل أقسام الساق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2.0 مل. أضف 1 مل من محلول برمنجنات البوتاسيوم 0.5٪ إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأقسام.
   1. ماصة محلول برمنجنات البوتاسيوم 0.5٪ لأعلى ولأسفل برفق ، ويفضل أن يكون ذلك دون إزعاج الأقسام. احتضن لمدة 2 دقيقة وكرر سحب العينات. دع أنبوب الطرد المركزي الدقيق يقف حتى تستقر جميع الأقسام.
      ملاحظه: احرص على عدم إدخال الماصة في طرف الماصة حيث قد تتلف المقاطع. قد يكون من الصعب رؤية أقسام الجذع لأن المحلول مظلم ، لذا احتفظ بالأنبوب مع الأقسام الموجودة على رف أنبوب الاختبار واتركها تستقر لمدة دقيقتين.
   2. باستخدام ماصة سعة 1 مل، اسحب 700 ميكرولتر من محلول برمنجنات البوتاسيوم 0.5٪. أضف 700 ميكرولتر من الماء المقطر لشطف محلول برمنجنات البوتاسيوم. كرر 3-4 مرات أو حتى يظل محلول الماء صافيا.
   3. تخلص من الماء. أضف بسرعة 1 مل من 3٪ حمض الهيدروكلوريك حتى يتم تفريغ اللون البني الغامق من الأقسام. قد يحدث هذا في غضون 3-5 دقائق أو قد يتطلب غسلتين مدة كل منهما 5 دقائق. قم بإخراج كل محلول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 3٪ وانتقل على الفور إلى الخطوة التالية.
   4. أضف 1 مل من محلول هيدروكسيد الأمونيوم المركز. استخدم ماصة سعة 1 مل مع قطع الطرف بحيث يمكن سحب المقاطع بسهولة دون تلف. ضع أقسام الماصة برفق في الطرف وعلى شريحة المجهر. قم بتغطية الأقسام بغطاء راقب الأقسام الموجودة تحت إضاءة المجال الساطع. (الشكل 1) < / > أنذر: نظرا لأن هيدروكسيد الأمونيوم شديد التآكل ، فإنه يتطلب مزيدا من العناية والاهتمام لتجنب التسبب في تآكل مرحلة المجهر أو العدسة.
      ملاحظه: يمكن لأبخرة هيدروكسيد الأمونيوم أن تعجب الغطاء ، مما يجعل من الصعب مراقبة العينة. لذلك ، كن حذرا جدا قبل إضافة الغطاء. يجف المحلول في غضون 5-10 دقائق ، لذلك يجب إكمال التصوير خلال تلك الفترة الزمنية.

النتائج

الشكل 1. تلطيخ Mäule من A. thaliana المقاطع العرضية الجذعية. تلطيخ Mäule (اللون الأحمر) من النوع البري A. thaliana الجذعية التي تظهر ترسب اللجنين الطبيعي في جدران الألياف بين اللفافات وخلايا نسيج الخشب (A-E). يشار إلى مواضع البشرة والقشرة (Ep) والألياف بين اللفافة (Fi) واللب (Pi) ونسيج الخشب (Xy). التكبيرات: اللوحة A: 5X; اللوحة ب: 10X ؛ اللوحة C: 20X; اللوحان D و E: 40X. شريط = 100 ميكرومتر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أغاروز EMD MERC2125 رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 9012-36-6 حمض الهيدروكلوريك EMD HX0603-75 رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 7647-01-0 الاهتزاز لايكا Leica تهتز شفرة microtome VT1000S http://www.leicabiosystems.com/ المنتجات/التقطيع/الاهتزاز-الميكروتوم/التفاصيل/المنتج/ LEICA-VT1000-S/ موسى شركة شفاقة السلامة الأمريكية الصنف # 60-0139-0000 شفرة مزدوجة الحواف من الفولاذ المقاوم للصدأ (Personna Super) أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات الغطاء اللولبي (2 مل) VWR 16466-044 أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (0.6 مل) أكسيجن العلمية MCT-060-C لاصق الأنسجة شركة تيد بيلا 10033 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية أو 20 درجة مئوية لمدة 3 أشهر أو أكثر كاميرا مع شريحة CCD بدون مصراع ميكانيكي هاماماتسو ج4742-95 برنامج الكاميرا الأجهزة الجزيئية إصدار MetaMorph 7.7.0.0 تخيل التحليل طُوب فوتوشوب CS4 نظارات مايكرو كشور ، مربع ، رقم 1 VWR هاتف: 48366-067 22 × 22 مم (7/8 × 7/8 بوصة) - نظارات الغطاء مقاومة للتآكل شرائح صغيرة بلوستد ، 1 مم VWR 48312-003 75 × 25 مم - 1 مم هيدروكسيد الأمونيوم EMD AX1303-6 رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 1336-21-6 برمنغنات البوتاسيوم سيغما 223468 رقم سجل المستخلصات الكيميائية 7722-64-7