تلطيخ الكالكوفلور الأبيض: طريقة بسيطة لتصور التألق الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية لرواسب السليلوز في جدران الخلايا للأقسام الجذعية لنبات ثنائي الفلقة

الملخص

المصدر: Pradhan M. et al. تلطيخ كيميائي نسيجي لعناصر جدار الخلية الثانوية نبات الأرابيدوبسيس thaliana. J. Vis. Exp. (2014)

في هذا الفيديو ، نصف إجراء تلطيخ لتصور ترسب السليلوز داخل جدران خلايا نبات الأرابيدوبسيس الثاليانا ، وهو نبات ثنائي الفلقة ، باستخدام اللون الأبيض الكالكوفلوري ، والذي يرتبط على وجه التحديد بالجلوكان المرتبط β ، ويظهر التألق تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تضمين الجذع

1. اصنع محلول الاغاروز بنسبة 7٪ في الماء (7 جم من الاغاروز بدرجة الرحلان الكهربائي في 100 مل من الماء المقطر). قم بإذابة الاغاروز عن طريق التعقيم لمدة 20 دقيقة أو عن طريق الميكروويف لمدة 20 دقيقة بأقل كثافة (على سبيل المثال ، كثافة 10٪ من ميكروويف 1،250 واط).
2. قم بإعداد قالب محلي الصنع لتضمين السيقان باستخدام قوارير بلاستيكية.
   1. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بقطع الجزء السفلي المخروطي لأنبوب الطرد المركزي الدقيق ذو الغطاء اللولبي سعة 2 مل (الجزء أ). باستخدام إبرة حقنة ، قم بثقب ثقب في غطاء الأنبوب أكبر قليلا من قطر الجذع المراد تضمينه. بعد ذلك ، قم بقطع 0.5 سم من قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق 0.6 مل (الجزء ب).
   2. أضف الجزء المقطوع 0.5 سم من أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 0.6 مل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المقطوع مسبقا 2 مل. أغلق الجزأين باستخدام Parafilm (الشكل 1).
      ملاحظة: يتم قطع الجزء السفلي من الأنبوب لتسهيل إزالة العينة المدمجة بعد تصلب الاغاروز. سيساعد الثقب الموجود في الغطاء في تثبيت الجذع عندما يكون الجذع جزءا لا يتجزأ من الاغاروز. سيعمل القالب على تثبيت الاغاروز وإمساك الجذع بشكل مستقيم عند التضمين. سيحتفظ البارافيلم بالجزأين ، A و B ، حتى يتم تثبيت الاغاروز وتضمين الساق.
   3. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بقص قسم جذعي من منطقة الاهتمام ، (على سبيل المثال منتصف الجزء الداخلي من الجذع الأول).
      ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب قطع الجذع قبل التضمين مباشرة لتجنب التدمير بسبب الجفاف. بدلا من ذلك ، يمكن تخزين الجذع مؤقتا في صفيحة تحتوي على ورق ترشيح مبلل بالماء. يمكن وضع هذه اللوحة على الجليد حتى تصبح جاهزة للانحناء لمنع جفاف الأنسجة وتشوهها. سيؤدي تخزين الجذع لفترات أطول من 30 دقيقة بدون رطوبة عالية إلى جفاف الساق.
3. قم بإذابة الاغاروز في الميكروويف بكثافة منخفضة.
   تنبيه: قد تكون الزجاجة التي تحتوي على الاغاروز ساخنة. استخدم قفاز لالتقاط الزجاجة. دع الاغاروز المذاب يقف في درجة حرارة الغرفة (بين 20 درجة مئوية و 25 درجة مئوية) حتى يبرد إلى حوالي 50 درجة مئوية.
4. ضع الماصة ببطء 5 مل من الاغاروز في القالب البلاستيكي الجاهز لملء القارورة.
   ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في القوالب. ستسبب فقاعات الهواء فجوات في قالب الاغاروز ولن تغطي عينة الساق بالكامل ، مما سيؤدي في النهاية إلى قطع غير متساو لأقسام العينة.
   1. دع الاغاروز يبرد لمدة 30 إلى 60 ثانية ليصبح شبه صلب. اختبر باستخدام عود أسنان صغير ، وتأكد من أنه يمكن أن يخترق ويقف ، ولكن لا يطفو ، في الاغاروز.
      ملاحظة: إذا تم وضع الجذع عندما لا يزال الاغاروز ساخنا ، فسيؤدي ذلك إلى إتلاف العينة عن طريق ذبول الجذع ، مما يؤدي إلى تدمير مورفولوجيا الخلية.
   2. ضع الجذع في هذه القارورة المليئة بالأغروز. تأكد من بقاء الجذع مستقيما. ضع الغطاء المثقوب بحيث يتم تثبيت طرف الساق بواسطة الغطاء. لا تقم بتشغيل الغطاء اللولبي. في وقت ما يمكن تضمين أكثر من جذع واحد (من نوع واحد) في قارورة واحدة. ولكن في هذه الحالة بالذات ، لا تستخدم cap.
      ملاحظة: إذا تم تدوير الغطاء اللولبي ، فسوف يلتوي الجذع.
5. اترك القارورة في درجة حرارة الغرفة أو عند 4 درجات مئوية لمدة 10-30 دقيقة ، حتى تتماسك.
6. قم بإزالة القالب عن طريق تحريكه برفق خارج الأنبوب. افتح Parafilm. ادفع الجزء السفلي من الجزء ب من القالب برفق بالإبهام لتحرير الاغاروز المتصلب من الجزء أ على شريحة مجهر زجاجي.
7. قطع جذع الاغاروز المدمج إلى ثلاث قطع متساوية تقريبا بطول 1.2 سم. اقطع جزء الجذع الذي لم يكن في الاغاروز وتخلص منه.
   1. قم بتخزين هذه القطع من الاغاروز مع السيقان المدمجة في أنابيب طرد مركزي دقيقة محكمة الإغلاق سعة 2 مل في صندوق مظلم عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للتقسيم. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الأنابيب عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد كحد أقصى.
      ملاحظة: التخزين ممكن ، ولكن يجب أن يدرك المجرب أن السيقان المضمنة لا تزال على قيد الحياة ، واعتمادا على التجربة ، يمكن إدخال القطع الأثرية.

< p class = "jove_title" >2. التقسيم الجذعي

تنبيه: اقرأ دليل الاهتزاز بعناية واتبع جميع تعليمات السلامة.

1. تأكد من أن قرص العينة نظيف وجاف تماما (خال من أي مادة صلبة أو سائلة). نظف قرص العينة بشفرة حلاقة لإزالة أي غراء متبقي من التجارب السابقة واغسله بالماء. ثم جفف بمنشفة ورقية.
   ملاحظة: سيضمن ذلك أن المادة اللاصقة تعمل بشكل جيد وترتبط بعينة الاغاروز. إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة بشكل صحيح ، فمن المحتمل ألا تلتصق العينة بالقرص وستتسبب لاحقا في سقوط العينة من القرص أثناء التقسيم.
   1. استخدم مناديل ورقية ناعمة لإزالة أي رطوبة من كتلة الاغاروز التي تحتوي على العينات.
   2. ضع قطرة صغيرة من لاصق المناديل على قرص العينة. قم بإخراج المادة اللاصقة لتغطية المنطقة الموجودة في منتصف اللوحة باستخدام طرف الزجاجة اللاصقة. ضع كتلة الاغاروز بسرعة بحيث تكون العينات إما متعامدة مع اللوحة أو بالتوازي معها للمقاطع العرضية أو الطولية ، على التوالي. اسمح للمادة اللاصقة بتثبيت العينة على قرص العينة في درجة حرارة الغرفة أو عند 4 درجات مئوية لمدة 10-30 دقيقة < / > ملاحظة: هذه خطوة حساسة للوقت.
2. ثبت قرص العينة في مكانه على الدرج المؤقت أو الحوض الصغير. يجب أن تكون كتلة / كتل الاغاروز مع الأقسام موازية لشفرة الحلاقة. املأ الدرج العازل بالماء المقطر في درجة حرارة الغرفة حتى تغمر العينات بالكامل.
3. اقطع شفرة الحلاقة إلى نصفين ثم قم بقص الأطراف بمقص قوي حتى تظل الشفرة مسطحة تماما. قم بتوصيل نصف شفرة الحلاقة المقطوعة مسبقا بحامل السكين.
   1. اضبط الزاوية على حامل السكين على 84 درجة ، والسرعة على 0.90 مم / ثانية (الموضع 8 على الاهتزاز) والتردد على 50 هرتز (الموضع 5 على الاهتزاز). قطع أقسام بسمك 100 ميكرومتر. استخدم الوضع المستمر.
      ملاحظة: تم اختيار هذا السماكة للتأكد من أن الأنسجة يمكن أن تتحمل العلاجات الحمضية والقاعدية المختلفة المستخدمة في بعض بروتوكولات التلوين. اضبط النافذة للتقسيم واترك 15-20 دقيقة في الوضع المستمر للاهتزاز لتقسيم كتلة الاغاروز التي يبلغ طولها حوالي 1.2 سم.
4. اجمع الأقسام باستخدام ماصة بلاستيكية يمكن التخلص منها أثناء التقسيم في الدرج المؤقت. بدلا من ذلك ، يمكن نقل الأقسام من الدرج العازل إلى دورق زجاجي ثم إلى لوحة بتري شفافة. انقل بعض الأقسام إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2.0 مل.
   ملاحظة: يتم جمع العينات من لوحة بتري لأنه من الأسهل رؤية الأقسام على خلفية واضحة ، ولأنه يمكن تحضير الدرج المؤقت للعينة التالية.
5. يمكن تخزين الأقسام في أنبوب سعة 50 مل أو جمعها وتخزينها في أنابيب طرد مركزي دقيقة من 1.5 إلى 2 مل عند 4 درجات مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة < / > ملاحظة: سيؤدي تخزين الأقسام لفترات أطول إلى ضعف جودة الصورة.

فئة

3. تلطيخ أبيض Calcofluor

1. قم بإذابة 0.02 جم من منير الفلورسنت 28 (كالكوفلور أبيض M2R) في 10 مل من الماء المقطر لتحضير محلول مخزون 0.2٪. يمكن تخزين محلول 0.2٪ لمدة ستة أشهر في زجاجة داكنة عند 4 درجات مئوية ، قم بإعداد محلول عملي بنسبة 0.02٪ عن طريق تخفيف محلول المخزون 0.2٪ 10x بالماء المقطر.
2. انقل أقسام الساق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2.0 مل. أضف إلى الأنبوب 1 مل من محلول الكالكوفلور الأبيض 0.02٪. قم بتمرير الماصة برفق المحلول الأبيض الكالكوفلوري بنسبة 0.02٪ لأعلى ولأسفل.
   ملاحظة: احرص على عدم إدخال الأقسام في طرف الماصة لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الأقسام.
   1. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وكرر سحب العينات. احتضن القسم لمدة 3 دقائق أخرى في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: اترك الأقسام تستقر في قاع الأنبوب لتسهيل إخراج المحلول دون إتلاف الأقسام.
   2. استخدم ماصة سعة 1 مل لسحب 700 ميكرولتر من محلول كالكوفلور الأبيض 0.02٪ وإضافة 700 ميكرولتر من الماء المقطر؛ انتظر لمدة 5 دقائق لشطف محلول الكالكوفلور الأبيض. كرر الغسيل 3-4x. استخدم ماصة سعة 1 مل مع قطع طرف الماصة بطريقة يمكن بها سحب الأقسام بسهولة دون تلف.
   3. ضع أقسام الماصة برفق في الطرف وعلى شريحة مجهرية وقم بتغطيتها بغطاء غطاء. راقب الأقسام تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

النتائج

الشكل 1. قالب محلي الصنع لتضمين السيقان. على الجانب الأيسر الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق ذو الغطاء اللولبي سعة 2 مل (الجزء أ) والجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 0.6 مل (الجزء ب). على الجانب الأيمن. البارافيلم الذي يحمل الجزأين. A و B لتشكيل القالب النهائي.

المواد