مقالة منهجية

تنقية البروتين القائم على كروماتوغرافيا تبادل الأنيونات: تقنية فصل لعزل بروتين ذي أهمية من محللة البكتيريا المحللة بالكلى بناء على صافي الشحنة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Fuehner ، S. ، et al. تنقية S100A12 البشرية وقلة القلة التي يسببها الأيونات لتحفيز الخلايا المناعية J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية كروماتوغرافيا تبادل الأنيون لتنقية S100A12 البروتين البشري المرتبط بالكالسيوم بناء على صافي الشحنة السطحية للبروتين من ثقافة الإشريكية القولونية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تنقية البروتين

  1. كروماتوغرافيا تبادل الأنيون
    1. غسيل الكلي
      1. قم بإعداد المخزن المؤقت لكروماتوغرافيا تبادل الأنيون (AIEX) A عن طريق إذابة 20 ملي مولار تريس ، 1 ملي مولار EDTA و 1 ملي مولار من الإيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N '، N'، N'-حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) في الماء منزوع الأيونات وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.5 مع حمض الهيدروكلوريك. لغسيل الكلى ، قم بإعداد 2 × 5 لتر وللكروماتوغرافيا 2 × 1 لتر من عازلة AIEX A.
        ملاحظه: يجب أن يكون حجم غسيل الكلى حوالي 100 ضعف حجم العينة. يجب ترشيح جميع المخازن المؤقتة المستخدمة في الكروماتوغرافيا (0.45 ميكرومتر أو أصغر) وتفريغها (على سبيل المثال ، عن طريق الحمام بالموجات فوق الصوتية أو التفريغ بالفراغ).
      2. قطع أنابيب غسيل الكلى (قطع الوزن الجزيئي [MWCO]: 3.5 كيلو دالتون) إلى طول مناسب مع مساحة إضافية للهواء لضمان طفو العينة فوق قضيب التحريك الدوار.
        ملاحظه: يحافظ الجلسرين على الغشاء ويجب إزالته قبل الاستخدام.
      3. لتقليل لزوجة محلول البروتين الذي تم تطهيره ، قم بتخفيف المحلول ب 25 مل من المخزن المؤقت AIEX A لتسهيل التطبيق اللاحق على عمود الكروماتوغرافيا. قم بتوصيل الإغلاق الأول بالأنبوب ، وقم بتحميل العينة في الغشاء وقم بتوصيل الإغلاق الثاني على بعد 1 سم على الأقل من الطرف العلوي للأنبوب.
      4. ضع الحاوية سعة 5 لتر مع المخزن المؤقت AIEX A على طبق التحريك ، وأضف قضيب التحريك والغشاء المملوء بمحلول البروتين. اضبط السرعة لتدوير العينة عن طريق تجنب التداخل مع قضيب التحريك الدوار. غسيل الكلى لمدة 12-24 ساعة عند 4 درجات مئوية، ثم استبدل عازلة غسيل الكلى (AIEX buffer A) بمستحضر جديد مبرد مسبقا واستمر لمدة 4 ساعات إضافية على الأقل. انقل محلول البروتين المخلل إلى أنبوب سعة 50 مل وقم بالتصفية من خلال وحدة مرشح 0.45 ميكرومتر.
        ملاحظه: التخزين ممكن.
    2. اللوني
      1. ابدأ نظام الكروماتوغرافيا السائلة (FPLC) بالصيانة العامة ، وقم بتوصيل المخازن المؤقتة للعمود AIEX A و AIEX B (AIEX buffer A مع 1 M NaClU) وراتنج تبادل الأنيون الذي يحتوي على عمود. راجع الجدول 1 للحصول على معلمات كروماتوغرافية عامة.
        ملاحظه: وينبغي موازنة المخازن المؤقتة والأعمدة وتجهيزات FPLC مع نفس درجة الحرارة قبل بدء التشغيل (راجع المعلمات الكروماتوغرافية في الجدول 1، الجدول 2).
        2. قم
      2. بموازنة العمود باستخدام المخزن المؤقت AIEX A ، ثم قم بتحميل العينة على العمود وقم بإزالة البروتينات بتدرج خطي من 0٪ إلى 100٪ عازلة عالية الملح (AIEX B). راجع الجدول 2 للحصول على بروتوكول طريقة مفصل.
      3. اجمع 2 مل من الكسور أثناء الشطف وقم بتحليل 10 ميكرولتر من كل جزء على الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد دوديسيل كبريتات الصوديوم 15٪ الملون بكوماسي (SDS-PAGE). تجمع الكسور التي تحتوي على بروتين S100A12 لغسيل الكلى.
        ملاحظه: الوزن الجزيئي ل S100A12 هو 10،575 دال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجدول 1: معلومات مفصلة عن المعلمات المطبقة لكروماتوغرافيا تبادل الأنيون.

حجم السرير (السيرة الذاتية) 75 مل مراقب الامتصاص عند 280 نانومتر أقصى ضغط 3 بار المخزن المؤقت للعمود أ 20 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك ، 1 ملي EDTA ، 1 ملي EGTA ، درجة الحموضة 8.5...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
25٪ حمض الهيدروكلوريك   كارل روث  X897.1
4− 20٪ جل بروتين Mini-PROTEAN TGX  BioRad  4561093
Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution  BioRad  1610438
Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution  BioRad  1610436
EDTA ثنائي الصوديوم ملح ثنائي هيدرات  كارل روث  8043.1
EGTA  كارل روث  3054.3
Q Sepharose Fast Flow  جنرال إلكتريك للرعاية الصحية  17-0510-01  راتنج لكروماتوغرافيا تبادل الأنيون
كلوريد الصوديوم (NaCl)  كارل روث  3957.2
هيدروكسيد الصوديوم  Carl Roth  P031.1
Tris Base  كارل روث  4855.3
0.45 µ مرشح المحقنة M  Merck  SLHA033SS
5 L قياس دورق   كارل روث  CKN3.1
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية   كورنينج  430829
إغلاق أنابيب غسيل الكلى  الطيف  132738
أنابيب تجميع الكسور 5 مل  Greiner  115101
غشاء غسيل الكلى الطيفي/بور (3.5 كيلو دالتون)الطيف  132724
وحدة تصفية Steritop  Merck  SCGPT01RE
Ä KTA purifier UPC 10  جنرال إلكتريك للرعاية الصحية  نظام FPLC
جامع الكسور  جنرال إلكتريك للرعاية الصحية  Frac-920
Mini Protean Tetra Cell  BioRad  1658000EDU
NanoPhotometer  Implen  P330
قياس الأس الهيدروجيني  Knick  765

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FPLC

مقالات ذات صلة