مقالة منهجية

كروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء المعتمدة على الكالسيوم: تقنية لتنقية البروتينات المرتبطة بالكالسيوم بناء على التفاعلات الكارهة للماء

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Fuehner، S.، et al.، تنقية S100A12 البشرية وأوليغومرات الأيونات لتحفيز الخلايا المناعية. J. Vis. Exp. (2019).

< p class = "jove_content">في هذا الفيديو ، نوضح تنقية البروتين المرتبط بالكالسيوم من محللة الخلايا المحللة من خلال كروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء المعتمدة على الكالسيوم. تكشف البروتينات المرتبطة بالكالسيوم عن منطقة كارهة للماء عند الارتباط بالكالسيوم ، مما يسهل التفاعل مع مجموعة كارهة للماء على الراتنج. في وقت لاحق يتم تصريف هذه البروتينات باستخدام مخلب الكالسيوم EDTA الذي يعكس التفاعل.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< ص فئة = "jove_title" >1. كروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء المعتمدة على الكالسيوم (التحالف الدولي للموئل)

  1. غسيل الكلي
      غسيل محلول
    1. البروتين مقابل 20 ملي مولار تريس ، 140 ملي كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.5
  2. اللوني
    1. إعداد 1 لتر من المخزن المؤقت الكروماتوغرافيا HIC A عن طريق إذابة 20 ملي تريس ، 140 ملي كلوريد الصوديوم و 25 ملي كلوريد الصوديوم 2 في الماء منزوع الأيونات وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.5. للمخزن المؤقت HIC B, إذابة 20 ملي تريس, 140 ملي كلوريد الصوديوم و 50 ملي إدتا. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0 وقم بتصفية المخازن المؤقتة وتفريغها. أضف CaCl2 إلى العينة إلى تركيز نهائي قدره 25 ملي مولار وقم بالتصفية من خلال 0.45 ميكرومتر. موازنة المخازن المؤقتة HIC والعينة إلى 4 درجة مئوية (درجة حرارة العمود).
    2. بدء نظام الكروماتوغرافيا السائلة مع الصيانة العامة, توصيل المخازن المؤقتة العمود HIC A و B والعمود. راجع الجدول 1 لمزيد من المعلمات الكروماتوغرافية.
    3. قم بموازنة العمود وتحميل العينة وتمديد كتلة "عينة الغسيل غير المنضمة" حتى تصل إشارة الأشعة فوق البنفسجية إلى مستوى خط الأساس مرة أخرى. ثم ابدأ الشطف باستخدام مخلب الكالسيوم المحتوي على عازلة (EDTA). راجع الجدول 2 للحصول على بروتوكول طريقة مفصل.
      ملاحظه: أظهرت التجارب السابقة أن فائض الكالسيوم يبدو مفيدا لربط S100A12 براتنج الكروماتوغرافيا.
    4. اجمع كسور الذروة البالغة 2 مل وقم بتحليل 10 ميكرولتر من كل جزء على صفحة SDS-15٪ ملطخة بكوماسي. تجمع S100A12 الكسور النقية وغسيل الكلى ضد محلول ملحي مخزن ب Hepes (HBS ؛ 20 ملي مولار Hepes ، 140 ملي كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.0).
      ملاحظه: معامل انقراض S100A12 الأحادي هو 2980 م -1 سم -1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجدول 1: معلومات مفصلة عن المعلمات المطبقة لكروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء.

حجز حجم مخزن مؤقت مخرج التوازن 1-2 وحدات تخزين الأعمدة (CVs) أ ضيع تحميل العينة غير متاح

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كيميائي ثنائي هيدرات ملح ثنائي الصوديوم EDTA كارل روث 8043.1 فينيل سيفاروز عالي الأداء جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-1082-01 راتنج لكروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) كارل روث 3957.2 هيدروكسيد الصوديوم كارل روث P031.1 قاعدة تريس كارل روث 4855.3 25٪ حمض الهيدروكلوريك كارل روث رقم X897.1 كالسيوم كلوريد ديهيدرات كارل روث 5239.1 أدوات المختبر مرشح حقنة 0,45 ميكرومتر ميرك SLHA033SS 14 مل أنابيب مستديرة دينار بحريني 352059 2 لتر قارورة إرلينماير كارل روث لي98.1 أنابيب تجميع الكسور 5 مل غرينر 115101 غشاء غسيل الكلى Spectra / Por (3.5 كيلو دالتون) طيف 132724 وحدة مرشح Steritop ميرك SCGPT01RE معدات جامع الكسور جنرال إلكتريك للرعاية الصحية فراك -920

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EDTA

مقالات ذات صلة