تنقية البروتين القائم على كروماتوغرافيا النيكل: تقنية لتنقية البروتينات المؤتلفة الموسومة بالبولي هيستيدين من محللة الخلايا البكتيرية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Pokhrel ، A. et al. A التنقية ومقايسة النشاط في المختبر ل (p) ppGpp Synthetase من المطثية العسيرة. J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية كروماتوغرافيا تقارب النيكل لتنقية إنزيمات البيروفوسفوكيناز الموسومة بالهيستيدين من بكتيريا المطثية العسيرة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تنقية البروتين بواسطة كروماتوغرافيا تقارب النيكل

1. قم بتنقية البروتين باستخدام 1 مل من راتنج حمض النيكل النتريلوأسيتيك (Ni-NTA) على عمود الجاذبية.
   1. في اليوم السابق للاستخدام ، قم بموازنة العمود طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع 2 مل من المخزن المؤقت للتوازن (10 ملي مولار Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 7.79 ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 50 ملي هيدروهيدروكسيد₂PO₄ ، 0.5 مجم / مل ليزوزيم ، 5 ملي ملي MgClCl₂ ، 10 ملي إيميدازول ، 0.25 ملي DTT ، 5 ملي مولار فلوريد سلفونيل فينيل ميثان (PMSF) ، 10٪ جلسرين).
   2. في اليوم التالي ، أحضر العمود من 4 درجات مئوية إلى RT قبل تحميل المحللة الموضحة واتركه يقف لمدة ~ 2-3 ساعة
      ملاحظه: يعد جلب العمود إلى التوازن الحراري أمرا بالغ الأهمية لتجنب تشكل فقاعات الهواء داخل العمود.
   3. أعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت للتحلل (10 ملي مولار Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 7.8 ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي ملي كلوريد_{الصوديوم 2} ، 50 ملي هيدروهيدرات_{هيدروكسيد 2}PO₄ ، 10٪ جلسرين ، 0.5 مجم / مل ليزوزيم ، 10 ملي إيميدازول ، 0.25 ملي DTT و 5 ملي PMSF).
   4. صوتنة الخلايا على الجليد لفترات 8 × 10 ثوان ، وتوقف مؤقتا لمدة 30 ثانية بين النبضات.
   5. قم بتوضيح المحللة عن طريق الطرد المركزي عند 3,080 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق.
   6. قم بإعداد المحللة بكميات متساوية من المخزن المؤقت للتحلل ثم قم بتطبيق المحللة المصفاة الجاهزة على العمود واجمع التدفق.
   7. أعد تطبيق تدفق المحللة الموضح على العمود وجمع التدفق الثانوي.
   8. اغسل العمود بمخزن الغسيل 1 (10 ملي Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.79) ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي ملي كلوريد_{الصوديوم 2} ، 50 ملي هيدروكسيد_{الصوديوم 2}PO₄ ، 30 ملي إيميدازول ، 10٪ جلسرين). اجمع التدفق.
      ملاحظة: يعد إدراج 5 ملي مولار MgCl₂ في مخازن الغسيل والشطف أمرا مهما للنشاط الأنزيمي للبروتين المنقى.
   9. اغسل العمود بمخزن الغسيل 2 (10 ملي Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.79) ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي ملي كلوريد_{المغنيد 2 ، 50} ملي هيدروكسيد_{هيدروكسيد 2}PO₄ و 50 ملي مولار إيميدازول).
   10. اجمع التدفق.
   11. ضع 2 مل من محلول الشطف (10 ملي Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.79) ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 50 ملي هيدروهيدروكسيد₂PO₄ ، 10٪ جلسرين و 75 ملي إيميدازول). اجمع التدفق في جزأين من 1 مل لكل منهما.
       ملاحظه: يمكن تخزين العمود بعد هذه الخطوة في مخزن مؤقت للتوازن عند 4 درجات مئوية إذا كان سيتم تنقية نفس البروتين في مقايسة التنقية التالية. يمكن استخدام العمود حتى 3 مرات إذا تم تخزينه بشكل صحيح.

المواد