الفصل القائم على كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة لمتغيرات حمض الميكوليك: طريقة لفصل دهون جدار الخلايا الفطرية بناء على القطبية

الملخص

المصدر: Guallar-Garrido، S.، et al. تحليل التركيب الدهني للبكتيريا الفطرية بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو فصل الأحماض الفطرية القائم على الطبقة الرقيقة الكروماتوغرافيا. تفصل هذه التقنية بين الأحماض الفطرية المختلفة - الدهون طويلة السلسلة الموجودة في جدار خلية البكتيريا الفطرية - بناء على قطبيتها.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. استخراج إجمالي الدهون غير التساهمية من البكتيريا الفطرية (الشكل 1)

1. خدش 0.2 جم من البكتيريا الفطرية من وسط صلب وأضفه إلى أنبوب زجاجي بأغطية لولبية بطانة بولي رباعي فلورو إيثلين (PTFE). أضف محلولا يتكون من 5 مل من الكلوروفورم و 10 مل من الميثانول (الكلوروفورم: الميثانول ، 1: 2).
   ملاحظه: عند استخدام المذيبات العضوية ، يجب استخدام متلقي الزجاج فقط. لا يسمح بالحاويات البلاستيكية. علاوة على ذلك ، هناك حاجة إلى أغطية لولبية بطانة PTFE للزجاجات.
   أنذر: الكلوروفورم مادة يحتمل أن تكون سامة وشديدة الخطورة. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
   أنذر: الميثانول مادة يحتمل أن تكون سامة وشديدة الخطورة. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
2. اترك الأنبوب في حالة تحريك مستمر طوال الليل لاستخراج الدهون غير التساهمية من سطح الخلية الفطرية.
   ملاحظه: في حالة عدم توفر منصة اهتزاز مدارية ، يمكن استبدال التقليب المستمر بالتقليب اليدوي الدوري قدر الإمكان.
3. قم بتغطية قمع زجاجي بورق ترشيح ، وقم بتصفية المذيبات العضوية ، واجمعها في أنبوب زجاجي.
4. استخدم تدفق غاز النيتروجين لتبخير الطور السائل في الأنبوب. املأ الأنبوب بغاز النيتروجين ، وقم بتغطيته وتخزينه عند 4 درجات مئوية < / > ملاحظه: قم بتوصيل ماصة باستور زجاجية بتيار غاز النيتروجين لتبخير الأنبوب المطلوب على وجه التحديد. بالإضافة إلى ذلك ، حافظ على الأنبوب داخل سخان بلوك جاف للأنابيب عند 37 درجة مئوية. عندما يتبخر المذيب ، املأ الأنبوب بغاز النيتروجين قبل إغلاقه.
5. أضف 15 مل من محلول الكلوروفورم: الميثانول (2: 1) إلى الحطام الخلوي. اترك الأنبوب في حالة تحريك مستمر طوال الليل لاستخراج الدهون غير التساهمية من سطح الخلية الفطرية.
   ملاحظه: في حالة عدم توفر منصة اهتزاز مدارية ، يمكن استبدال التقليب المستمر بالتقليب اليدوي الدوري قدر الإمكان.
6. دع الخليط يرتاح لمدة 1 ساعة. باستخدام ماصة باستور ، استرجع المذيبات العضوية. قم بتغطية قمع زجاجي بورق ترشيح وقم بتصفية المذيبات العضوية واجمعها في نفس الأنبوب الزجاجي المستخدم سابقا في الخطوة 1.3. استخدم تدفق غاز النيتروجين لتبخير الطور السائل في الأنبوب. املأ الأنبوب بغاز النيتروجين وأغلقه وقم بتخزينه مرة أخرى عند 4 درجات مئوية.

< p class = "jove_title" >2. استخراج حمض المكوليك عن طريق تحلل الميثانول الحمضي (الشكل 2 أ)

1. أضف 2-5 مل من محلول الأسترة في أنبوب زجاجي محكم مع غطاء لولبي بطانة PTFE. أضف 0.2 جم من الكتلة الحيوية للبكتيريا الفطرية إلى الأنبوب الزجاجي.
   ملاحظه: يتكون محلول الأسترة عن طريق خلط 30 مل من الميثانول و 15 مل من التولوين و 1 مل من حمض الكبريتيك. يمكن أخذ خلايا البكتيريا الفطرية من المزارع الصلبة أو حتى من الخلايا المدهونة بعد إجراء استخراج إجمالي الدهون غير التساهمية من البكتيريا الفطرية (الخلايا المتبقية بعد التصفية في الخطوة 1.6).
   أنذر: التولوين مادة قابلة للاشتعال وخطيرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
   أنذر: حمض الكبريتيك مادة مسببة للتآكل وخطرة. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
2. امزج المحتوى عن طريق الدوامة. دع الخليط يقف داخل حمام جاف عند 80 درجة مئوية طوال الليل.
3. اترك الأنبوب يبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة ثم أضف 2 مل من n-hexane إلى الأنبوب. امزج المحتويات عن طريق الدوامة لمدة 30 ثانية واترك الأنبوب يستقر حتى تظهر مرحلتان واضحتان.
   تنبيه: n-hexane مادة محتملة قابلة للاشتعال ومهيجة وضارة بالبيئة وشديدة الخطورة. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
4. استرجع المرحلة العليا المقابلة لمرحلة n-hexane. انقله إلى أنبوب جديد.
5. كرر الخطوة 2.3. استرجع المرحلة العليا مرة أخرى وانقلها إلى نفس الأنبوب المستخدم في الخطوة 2.4.
6. تبخر محتويات الأنبوب باستخدام تدفق غاز النيتروجين. املأ الأنبوب بغاز النيتروجين وأغلقه وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية.

< p class = "jove_title" >3. استخراج حمض المكوليك عن طريق التصبن والمثيلة (الشكل 2 ب)

1. خدش 0.2 غرام من البكتيريا الفطرية من وسط صلب وأضفه إلى أنبوب زجاجي بغطاء لولبي PTFE.
2. أضف 2 مل من محلول الميثانول والبنزين (80:20) الذي يحتوي على 5٪ هيدروكسيد البوتاسيوم. امزج المحتويات عن طريق الدوامة. سخني الخليط لمدة 3 ساعات عند 100 درجة مئوية
   أنذر: البنزين مادة قابلة للاشتعال ومسرطنة وخطرة. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
3. اترك الأنبوب يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 20٪ حمض الكبريتيك لتحمض العينات لتحقيق الرقم الهيدروجيني = 1.
4. أضف 3 مل من ثنائي إيثيل الأثير. امزج المحتويات برفق عن طريق الدوامة.
5. دع المرحلتين تشكلان عن طريق الاستقرار. استرجع مرحلة ثنائي إيثيل الأثير ونقلها إلى أنبوب جديد. كرر خطوة الغسيل لمدة ثلاث مرات.
6. اغسل مستخلص ثنائي إيثيل الأثير ب 2 مل من الماء المقطر وانقل الجزء العلوي المقابل لثنائي إيثيل الأثير إلى أنبوب جديد. كرر خطوة الغسيل لمدة ثلاث مرات.
7. أضف 2 جم من كبريتات الصوديوم اللامائية فوق مستخلص ثنائي إيثيل الأثير لتجفيفه.
8. قم بتصفية التعليق. تبخر المحتوى باستخدام تدفق غاز النيتروجين.
9. لتنفيذ خطوة المثيلة ، قم بإذابة 3 جم من اليوريا N-nitroso-N-methyl في محلول مبرد مسبقا يتكون من 45 مل من ثنائي إيثيل الأثير و 9 مل من 40٪ KOH في الماء المقطر><. أنذر: N-nitroso-N-methylurea مادة سامة ومهيجة ومسرطنة وخطرة. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
10. انقل المادة الطافية (الديازوميثان) إلى قارورة جديدة مبردة في الثلج تحتوي على كريات هيدروكسيد البوتاسيوم (حوالي 30 جم).
    ملاحظه: إذا لم يتم استخدام المادة الطافية على الفور ، فيمكن تخزينها عند -20 درجة مئوية لمدة أقصاها 1 ساعة < / > أنذر: كريات هيدروكسيد البوتاسيوم مادة مهيجة ومسببة للتآكل. يجب استخدام هذه المادة في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
    أنذر: الديازوميثان شديد السمية ويمكن أن يكون متفجرا. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مع زجاج الأمان الذي يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
11. أضف 2 مل من محلول الأثير المحتوي على الديازوميثان ، الذي تم الحصول عليه في الخطوة 3.10 ، إلى مستخلص ثنائي إيثيل الأثير المجفف الذي يحتوي على الأحماض الفطرية ، التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.8. احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
12. تبخر التعليق عند 40 درجة مئوية. املأ الأنبوب بغاز النيتروجين ، وأغلقه ، وقم بتخزين الدهون الميثيلية عند 4 درجات مئوية < br / > ملاحظه: تبخر الديازوميثان من محلول الأثير تحت غطاء التدفق الصفحي ، حتى يفقد الأثير اللون الأصفر.

< p class = "jove_title" >4. تحليل كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC)

1. تشبع غرفة TLC الزجاجية. للقيام بذلك ، قم بتغطية أحد جدران غرفة TLC بقطعة من ورق الترشيح واتركه على اتصال بالمرحلة المتحركة المكونة من خليط المذيبات. ضع الحجم المتبقي من المذيب في قاع غرفة TLC.
   ملاحظه: يجب تغطية الجزء السفلي من غرفة TLC بما لا يقل عن 1 سم من المرحلة المتنقلة. في التجارب الحالية ، تم استخدام مراحل متنقلة مختلفة لتطوير TLCs. وهي تتألف من 85 مل من n-hexane بالإضافة إلى 15 مل من ثنائي إيثيل الأثير. 100 مل من ثنائي كلورو ميثان ؛ 90 مل من الكلوروفورم ، و 10 مل من الميثانول ، و 1 مل من الماء ؛ 30 مل من الكلوروفورم ، بالإضافة إلى 8 مل من الميثانول ، و 1 مل من الماء ؛ 60 مل من الكلوروفورم ، بالإضافة إلى 35 مل من الميثانول ، و 8 مل من الماء ؛ 95 مل من الكلوروفورم بالإضافة إلى 5 مل من الميثانول ؛ و 90 مل من الأثير البترولي (60-80 درجة مئوية) بالإضافة إلى 10 مل من ثنائي إيثيل الأثير.
   ملاحظه: في TLC ثنائي الأبعاد ، استخدم n-hexane: acetone (95: 5) في الاتجاه الأول ثلاث مرات ، واستخدم تطورا واحدا مع التولوين: الأسيتون (97: 3) في الاتجاه الثاني لتحليل تكوين حمض الصمغ. لتحليل PIMs ، استخدم الكلوروفورم: الميثانول: الماء (60: 30: 6) في الاتجاه الأول مرة واحدة ، واستخدم الكلوروفورم: حمض الخليك: الميثانول: الماء (40: 25: 3: 6) في الاتجاه الثاني. لتحليل PDIM و AG ، استخدم الأثير البترولي (60-80 درجة مئوية): أسيتات الإيثيل (98: 2) في الاتجاه الأول ثلاث مرات ، واستخدم تطورا واحدا مع الأثير البترولي (60-80 درجة مئوية): الأسيتون (98: 2) في الاتجاه الثاني.
   أنذر: ثنائي إيثيل الأثير مادة سامة وخطرة محتملة. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
   أنذر: ثنائي كلورو ميثان مادة يحتمل أن تكون سامة وخطرة. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
   أنذر: الأثير البترولي مادة محتملة قابلة للاشتعال ومضمرة بالبيئة وشديدة الخطورة. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
   أنذر: حمض الخليك هو مادة محتملة قابلة للاشتعال والتآكل. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
   أنذر: أسيتات الإيثيل مادة قابلة للاشتعال وخطرة. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
   أنذر: الأسيتون مادة قابلة للاشتعال وخطرة. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
2. أغلق غرفة TLC لتشبعها لمدة 20 دقيقة على الأقل. وفي الوقت نفسه ، قم بإذابة الدهون الموجودة في الأنبوب الزجاجي في 0.2-1 مل من الكلوروفورم.
   ملاحظه: يمكن تعديل الحجم المستخدم لإذابة الدهون اعتمادا على التركيز المطلوب أو المتوقع للعينة.
3. ضع 10 ميكرولتر من كل تعليق باستخدام أنبوب زجاجي شعري مباشرة على لوحة TLC واترك العينة تجف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: يجب وضع العينات في الجزء السفلي من اللوحة مع ترك 1 سم على كل جانب. يجب فصل العينات عن بعضها البعض لمدة لا تقل عن 0.5 سم. بمجرد تطبيق العينة على اللوحة ، يمكن تبخير الأنابيب مرة أخرى بغاز النيتروجين وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمزيد من الاستخدام.
4. أدخل اللوحة في غرفة TLC المشبعة التي تحتوي على المرحلة المتحركة. السماح لمرحلة الهاتف المحمول بالعمل من خلال TLC.
   ملاحظه: تؤثر أي حركة مطبقة على غرفة TLC على المذيب الجاري على اللوحة وتؤثر على حركة الدهون. في حالة إجراء TLC ثنائي الأبعاد ، يلزم وجود غرفتين TLC لاحتواء نظامي الشطف.
5. قم بإزالة اللوحة من غرفة TLC عندما يصل المذيب إلى مسافة 1 سم من الطرف العلوي للوحة. اترك اللوحة تحت التدفق الرقائقي حتى تجف السيليكا تماما.
   ملاحظه: في حالة تحليل تركيبة حمض المكوليك ، باستخدام n-hexane و diethyl-ether (85:15) ، كرر الخطوتين 4.4 و 4.5 مرتين إضافيتين ، حتى تشغيل المرحلة المتنقلة ثلاث مرات فوق لوحة TLC.
6. اكشف عن اللوحة مع البقعة المطلوبة ؛ قم بتسخين اللوحة إذا لزم الأمر.
   ملاحظه: في هذه التجربة ، تم استخدام 15-20 مل من المحاليل التالية لرش ألواح TLC: 10٪ هيدرات حمض الموليبداتوفوسفوريك في الإيثانول حتى تصبح الصفيحة صفراء زاهية ، متبوعة بتسخين اللوحة عند 120 درجة مئوية. 5٪ في الإيثانول بنسبة 20٪ α-نافثول في حامض الكبريتيك متبوعا بتسخين اللوحة عند 120 درجة مئوية ؛ كاشف الموليبدينوم الأزرق (1.3٪ أكسيد الموليبدينوم في 4.2 M حمض الكبريتيك) حتى ظهرت عصابات الفوسفات أو 1٪ في حمض الكبريتيك.
   أنذر: هيدرات حمض الموليبداتوفوسفوريك مادة قابلة للاشتعال ومسببة للتآكل. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
   أنذر: الإيثانول مادة محتملة قابلة للاشتعال وخطرة. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
   تنبيه: 1-النفثول مادة قابلة للاشتعال وتآكل وخطيرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).
   أنذر: كاشف رذاذ الموليبدينوم الأزرق مادة أكالة وسامة وخطيرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء التدفق الصفحي مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والنظارات الواقية وقفازات النتريل).

النتائج

p class = "jove_content" >
الشكل 1: مخطط إجراء استخراج محتوى الدهون من البكتيريا الفطرية المزروعة على الوسائط الصلبة. الخطوات الرئيسية لفك تشفير الدهون الموجودة على خلايا البكتيريا الفطرية.

< p class = "jove_content" >
الشكل 2: مخطط إجراء استخراج محتوى حمض الميكوليك من البكتيريا الفطرية المزروعة على الوسائط الصلبة. الخطوات الرئيسية لفك تشفير الأحماض الفطر...

المواد