كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني: تقنية لعزل البروتين المؤتلف المستهدف من تحلل خلايا الحشرات بناء على صافي الشحنة السطحية

الملخص

المصدر: Agamasu, C. et al. مؤتلف معالج بالكامل KRAS4b: عزل وتوصيف البروتين الفارنسيلات والميثيلي. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو تقنية كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني لعزل البروتين المؤتلف من بروتين خلية الحشرة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تنقية البروتين

1. إعداد المخازن المؤقتة A-H ، كما هو موضح في الجدول 1.

حل المخزن المؤقت عامل التخزين المؤقت (كل 20 ملم) الرقم الهيدروجيني كلوريد الصوديوم (مليمتر) إيميدازول (مليمتر) مغنكلوريد₂ TCEP أ هيبس 7.3 300 ريال - 5 1 ب هيبس 7.3 300 ريال 35 5 1 ج هيبس 7.3 300 ريال 500 جنيه 5 1 د مس 6.0 200 ريال - 5 1 ه مس 6.0 - - 5 1 ويف مس 6.0 100 - 5 1 ز مس 6.0 1000 - 5 1 ح هيبس 7.3 300 ريال - 1 1

2. تحضير مواد التنقية (انظر جدول المواد): كوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني بدون EDTA أو مخلبات أخرى ؛ عمود كروماتوغرافيا تقارب المعادن (IMAC) ، عمود كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني (CEX) ؛ مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر ؛ 2 M إيميدازول (الرقم الهيدروجيني = 7.5) ؛ جهاز طرد مركزي فائق القدرة على 100,000 × جم ؛ جهاز طرد مركزي عالي السرعة قادر على 4,000 × جم; وحدات مرشح الطرد المركزي (10 كيلو دالتون NMWL) ؛ مقياس الطيف الضوئي قادر على القراءة عند 280 نانومتر ؛ His6-التبغ فيروس حفر (TEV) البروتياز; وأجهزة الكروماتوغرافيا القادرة على خلط حلين عازلين ، وتطبيق الحلول على الأعمدة ، وإنشاء تدرج التدرج من العمود ، وجمع الكسور من الأعمدة.
3. قم بإزالة محللة خلايا الحشرات من غسيل الكلى وأجهزة الطرد المركزي عند 4,000 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة أي رواسب. لا تزال العينة النهائية التي تم تصللها والموضحة في هذه المرحلة ضبابية في كثير من الأحيان ولكن يمكن تطبيقها دون مزيد من المعالجة على عمود CEX اللاحق.
4. قم بإعداد عمود تبادل كاتيوني سعة 20 مل (انظر جدول المواد) عن طريق الغسيل بثلاث سير ذاتية من Buffer G ، ثم بثلاث سير ذاتية من Buffer F.
   ملاحظه: على الرغم من أننا لم نقم بتقييم الراتنجات الأخرى بدقة ، فقد وجد العديد من الزملاء دقة ضعيفة مع راتنجات أخرى غير راتنج SP Sepharose عالي الأداء.
5. قم بتخفيف 20 مل من العينة المحللة إلى تركيز نهائي من كلوريد الصوديوم يبلغ 100 ملي مولار بإضافة 20 مل من Buffer E وتطبيق العينة المخففة على عمود التبادل الكاتيوني.
6. استمر في تحميل العمود عن طريق إضافة عينات مخففة حديثا محضرة كما هو موضح أعلاه إلى أنبوب الحمل حيث يقترب التخفيف السابق من نهاية الحمل.
   ملاحظه: أدى تخفيف العينة بأكملها دفعة واحدة إلى 100 ملي كلوريد الصوديوم إلى فقدان كبير للبروتين المستهدف بسبب هطول الأمطار.
7. اغسل العمود إلى خط الأساس Abs280 باستخدام Buffer F. هذا يتطلب عادة 3 سيرة ذاتية. يتم التخلص من البروتين من العمود خلال تدرج 400 مل (20 CV) من Buffer F إلى 65٪ Buffer G ، تم جمعه في كسور 6 مل (الشكل 1 ب).
8. استمر في غسل العمود للحصول على 1.5 سيرة ذاتية إضافية (65٪ Buffer G) بمجرد اكتمال التدرج.

النتائج

p class = "jove_content" >
الشكل 1: المواد الهلامية SDS-PAGE لعملية التنقية. (أ) الاستيلاء على IMAC من المحللة. FNTA / B هي النطاقات المظلمة التي تهاجر عند ~ 48 كيلو دالتون و His6-MBP-tev-KRAS4b هو النطاق المظلم الذي يهاجر عند ~ 67 كيلو دالتون. M = سلم الوزن الجزيئي للبروتين ؛ T = البروتين الكلي ؛ L = تحميل المحللة / العمود الموضحة ؛ F = تدفق العمود من خلال. يتم تقويض الكسور بتدرج تركيز إيميدازول متزايد. (ب) تتوافق كس...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1.8 مل أنابيب القفل الآمن ، طبيعية إيبندورف 22363204 11 مم Cl SS متشابكة إدراج قوارير أخذ العينات الآلي الترمو: العلمية 30211 إس إم -1232 5427R أجهزة الطرد المركزي إيبيندور الأسيتونيتريل ، درجة HPLC فيشر للكيماويات A998-1 1 لتر عمود كروماتوغرافيا تبادل كاتيون (CEX) جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة 29018183 HiPrep SP Sepharose عالية الأداء Exactive Plus EMR مطياف الكتلة الترمو: العلمية قوارير جيلسون أنابيب 7x14 مم جنرال إلكتريك للرعاية الصحية BR-1002-12 جهاز طرد مركزي عالي السرعة / منضدة ثيرمو فيشر العلمي 05-112-114 د قادرة على ما يصل إلى 4,000 xg His6-Tobacco Etch Virus (TEV) البروتياز أدجين 92414 منقى وفقا ل Raran-Kurussi et al. (2017) إزالة علامات التقارب باستخدام TEV Protease. في: Burgess Brown N. (محرران) التعبير الجيني غير المتجانس في الإشريكية القولونية. طرق في البيولوجيا الجزيئية ، المجلد 1586. مطبعة هيومانا ، نيويورك ، نيويورك كوكتيل مثبط البروتياز بدون EDTA أو مخلبات أخرى ميليبور سيجما ص 8849 أسيتات الأمونيوم سيجما ألدريتش 09689-250 جرام غاز الأرجون إيرغاز أروب حمض الفورميك سيجما ألدريتش F0507-500MI استخدم درجة الكاشف أو أفضل نظام كروماتوغرافيا NGC بيورراد 78880002 نظام الكروماتوغرافيا NGC QuestTM 100 طقم الطارد الدهني مع حامل أفانتي للدهون القطبية 610023 النيتروجين السائل إيرغاز ني-ديوار وحدات تصفية الطرد المركزي فائقة الجودة ، 10 كيلو NMWL ميليبور سيجما UFC901008 غشاء PES فلاتر الطرد المركزي Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 مل أيكون UFC501024 جهاز طرد مركزي فائق بيكمان كولتر أوبتيما - L80K قادرة على 100,000 XG الفصول سيغما سي 3023