$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تحضير المخازن المؤقتة
- لتحضير محلول الغسيل ELISA ، أضف 3.94 جم من قاعدة Tris-base و 8.77 جم كلوريد الصوديوم و 1 جم من ألبومين مصل الأبقري (BSA) إلى 1 لتر من الماء منزوع الأيونات (DI). أضف 500 ميكرولتر بولي سوربات -20. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم.
- لتحضير المخزن المؤقت للحجب ، أضف 3.94 جم من قاعدة Tris و 8.77 جم كلوريد الصوديوم و 10 جم من BSA. أضف 500 ميكرولتر من بولي سوربات -20 إلى 1 لتر من ماء DI. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم.
- لتحضير مخزن الشطف (PBS) ، أضف 8.01 جم كلوريد الصوديوم ، و 2.7 جم كلوريد كلوريد ، و 1.42 جم Na2HPO4 ، و 0.24 جم KH2PO4 إلى 1 L DI الماء. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم
ملاحظه: يمكن صنع محلول 10x من هذا المخزن المؤقت وتخفيفه بماء DI حسب الحاجة.
< p class = "jove_title" >2. تحضير عينة OMV
- تنمو A. actinomycetemcomitans الخلايا إلى المرحلة الأسية المتأخرة (الكثافة البصرية عند 600 نانومتر من 0.7). قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي مرتين عند 10,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر.
- قم بتركيز المادة الطافية الخالية من البكتيريا باستخدام مرشحات قطع الوزن الجزيئي 50 كيلو دالتون. جهاز طرد مركزي فائق المحلول المركز عند 105,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
- أعد تعليق الحبيبات في PBS وأجهزة الطرد المركزي الفائقة مرة أخرى (105,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة) أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من PBS.
< p class = "jove_title" >3. تعبئة عمود S-1000
- امزج زجاجة المرق من وسط ترشيح الجل بقضيب تحريك زجاجي واسكب الحجم اللازم لملء العمود في زجاجة زجاجية ، بالإضافة إلى ما يقرب من 50٪ من الفائض (حوالي 135 مل). دع هذه الخرزات تجلس حتى تستقر ، ثم تصب السائل الزائد. أعد تعليق الخرزات في المخزن المؤقت للشطف ، بحيث يكون المحلول النهائي حوالي 70٪ (من حيث الحجم) هلام ، 30٪ مخزن مؤقت. إزالة الغاز من المحلول تحت الفراغ.
- قم بتركيب العمود الزجاجي عموديا باستخدام حامل دائري واملأه بمحلول شطف لترطيب جدران العمود. قم بتصريف المخزن المؤقت حتى يتبقى حوالي 1 سم فقط من المخزن المؤقت في العمود.
- دون إنشاء فقاعات ، قم بوضع حبات الماصة بعناية في العمود ، واملأ العمود إلى الأعلى. استمر في تصريف المخزن المؤقت الزائد طوال هذه العملية. تأكد من عدم ترك الخرزات تستقر تماما قبل إضافة حبات إضافية إلى أعلى العمود. يجب تعبئة العمود على ارتفاع حوالي 2 سم تحت قاع خزان العمود.
4. تحميل العينة وجمع الكسور
- قم بإزالة عازلة الشطف تحت الفراغ. اغسل العمود بمجلدين للعمود (180 مل) من المخزن المؤقت للشطف.
- اسمح للمخزن المؤقت المتبقي بالدخول إلى العمود بالكامل. بمجرد وصول المخزن المؤقت إلى الجزء العلوي من طبقة الهلام ، قم بعمل ماصة بعناية عينة سعة 2 مل تحتوي على OMVs (بتركيز دهني يبلغ حوالي 100 - 200 نانومول / لتر) على سطح الخرزات ، مع الحرص على عدم إزعاج أي من الخرزات الموجودة في الجزء العلوي من العمود. اسمح للعينة بالدخول بالكامل إلى الجل ، أي عندما لا يبقى أي سائل فوق طبقة الجل.
- أضف بعناية وببطء المخزن المؤقت للشطف أعلى عمود الجل. لا تزعج الطبقة العليا من الجل ، لأن ذلك سيؤدي إلى تخفيف العينة.
- ضع أنبوبا واحدا سعة 50 مل أسفل العمود وافتح العمود. اجمع أول 20 مل من مادة السواء. أضف مخزن مؤقت إضافي للشطف إلى أعلى العمود ، بعناية ، حسب الحاجة لضمان عدم جفاف العمود أبدا.
- ضع سلسلة من أنابيب 1.5 مل أسفل العمود. ابدأ العمود واجمع سلسلة من عينات 1 مل في كل أنبوب. أثناء جمع العينات ، استمر في إضافة مخزن مؤقت للشطف إلى أعلى العمود ، حسب الضرورة. كرر حتى يتم جمع 96 كسورا. أوقف العمود .
ملاحظه: يجب تخزين العينات عند -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل أو 4 درجات مئوية للتخزين قصير الأجل حتى مزيد من التحليل.
- لتنظيف العمود ، قم بتشغيل وحدة تخزين عمود واحدة (90 مل) تبلغ 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم عبر العمود. قم بتشغيل مجلدي عمود (180 مل) من المخزن المؤقت للشطف عبر العمود.