الكروماتوغرافيا السائلة للتفاعل الكارهة للماء المعتمدة على البوتيل: تقنية لتوصيف اقترانات الأجسام المضادة والأدوية بناء على التفاعلات الكارهة للماء

الملخص

المصدر: Oller-Salvia ، B. الترميز الجيني لحمض أميني غير متعارف عليه لتوليد اقتران الأجسام المضادة والأدوية من خلال تفاعل متعامد حيوي سريع. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو التوصيف القائم على الكروماتوغرافيا السائلة للتفاعل الكارهة للماء لاقترانات الأجسام المضادة والأدوية باستخدام عمود كروماتوغرافيا قائم على ترابط البوتيل ، تتميز اقترانات الأجسام المضادة والأدوية من خلال التفاعلات الكارهة للماء مع الترابط.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إنتاج وتوصيف الجسم المضاد

1. التعبير عن الجسم المضاد
   1. قم بإذابة قارورة من خلايا تعليق HEK في قارورة سعة 250 مل تحتوي على 50 مل من وسط التعبير المكملة ب 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 250 نانوغرام / مل أمفوتريسين B. حافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 8٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} في حاضنات مرطبة مزودة بشاكر عند 125 دورة في الدقيقة. تقسيم الخلايا إلى 0.3-0.5 × 10⁶ خلايا / مل (كل 2-3 أيام) مرتين على الأقل قبل التعداد.
   2. عند الوصول إلى كثافة 2.5 × 10⁶ خلايا / مل (2-3 أيام بعد الانقسام) ، قم بإعداد محلول جديد بحجم 100 ملي مولار CypK. لهذا الغرض ، تزن 64 مجم من CypK ، وأضف 2.5 مل من 0.1 هيدروكسيد الصوديوم ، والدوامة ، وتدور لأسفل لاستعادة جميع الجسيمات غير المذابة والصوتينات.
   3. أضف 2.5 مل من CypK (100 ملي في 0.1 مليون) إلى 42.5 مل من وسط التعبير المكمل بالمضادات الحيوية. تخلط جيدا ، وتضاف 250 ميكرولتر من 0.1 متر حمض الهيدروكلوريك ، وتعقيمها باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
   4. خفف 50 ميكروغرام من بلازميدات HC و LC pKym1 إلى 2.5 مل مع وسط مصل مخفض. في أنبوب منفصل ، قم بتخفيف 135 ميكرولتر من كاشف التعدي إلى 2.5 مل مع وسط مصل مخفض.
   5. بعد خمس دقائق من تحضير المحاليل ، اخلطي البلازميدات ومحلول كاشف التعدي واحتضانها لمدة 20 دقيقة للسماح بتكوين مجمعات بين الحمض النووي وكاشف التعداد.
   6. في غضون ذلك ، تقوم أجهزة الطرد المركزي ب 125 مليون خلية بالكثافة المستهدفة لمدة 5 دقائق عند 500 × جم ، وإعادة التعليق مع وسط التعبير الذي يحتوي على CypK وإضافة خليط كاشف الحمض النووي والتعديد. يمكن شراء CypK أو تصنيعه كما ورد سابقا.
   7. بعد احتضان الخلايا لمدة 20 ساعة ، أضف 250 ميكرولتر من معززات كاشف التعداء المضمنة في المجموعة.
   8. حصاد الأجسام المضادة من المادة الطافية بعد 6-7 أيام من إضافة CypK (لا يلزم تغيير الوسط أثناء التعبير).
      * بدلا من ذلك ، للحصول على عوائد أعلى وأكثر اتساقا ، يمكن إنشاء خط خلية مستقر كما هو موضح في Oller-Salvia et al. 2018. في هذه الحالة ، يتم التعبير عن trastuzumab (CypK) ₂ ببساطة عن طريق إضافة CypK 5 ملي مولار في وسط التعبير.
2. تنقية الجسم المضاد
   1. الطرد المركزي للخلايا لمدة 15 دقيقة عند 3000 × جم.
   2. قم بتصفية المادة الطافية بمرشح 0.45 أو 0.22 ميكرومتر. إذا أصبح المرشح مسدودا ، فاستبدله بمرشح جديد واستمر في التصفية. إذا حدث هذا بعد بضعة ملليلتر فقط ، فقم بالطرد المركزي للطافي لمدة 15 دقيقة إضافية عند 7000 × جم.
   3. أضف راتنج البروتين أ (2 مل / 100 مل من المادة الطافية) في عمود كروماتوغرافيا بولي بروبلين فارغ وقم بموازنة الراتنج بما لا يقل عن 5 أحجام من محلول غسيل الخرز (0.1 م فوسفات الصوديوم ، 150 ملي كلوريد الصوديوم).
   4. قسم المادة الطافية إلى أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل وأضف 5x مخزن غسيل الخرز (0.5 M فوسفات الصوديوم ، 150 ملي كلوريد الصوديوم) متبوعا براتنج البروتين A المتوازن مسبقا. ضع الأنبوب المخروطي على أسطوانة لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة لسحب الجسم المضاد في المادة الطافية لأسفل.
   5. بدلا من ذلك: أضف المادة الطافية على العمود مع ضعف حجم الراتنج الموصى به على الأقل واتركه يتدفق من خلاله. تأكد من عدم وجود كمية كبيرة من الأجسام المضادة المتبقية في المادة الطافية بواسطة SDS-PAGE. إذا كان هناك ، فقم بتصفية المادة الطافية من خلال الراتنج مرة أخرى.
   6. انقل البروتين أ الراتنج مع المادة الطافية إلى عمود واترك السائل يتدفق من خلاله.
   7. أضف 25 مل من محلول الغسيل (أو 10 أحجام راتنج على الأقل) واتركه يتدفق.
   8. قم بتخفيض الجسم المضاد ب 4 مل من سترات الصوديوم 0.1 M ، درجة الحموضة 3 ، على 1 مل من 1 M من الفوسفات المؤقت ، 150 ملي كلوريد الصوديوم.
   9. قم بتخفيف الجسم المضاد ب 10 مل من PBS ، والتركيز إلى 0.5-1 مل عن طريق ترشيح الطرد المركزي ، وتبادل المخزن المؤقت ثلاث مرات باستخدام PBS.
   10. تنقية العينات بواسطة FPLC باستخدام عمود بوتيل التحالف الدولي للموئل مع تدفق 0.5 مل / دقيقة و 0-100٪ التدرج في 30 دقيقة من المخزن المؤقت منخفض الملح (50 ملي مولار فوسفات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.0, 20٪ الأيزوبروبانول) في عازلة عالية الملح (1.5 م (NH4)₂SO₄, 50 مللي فوسفات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.0, 5٪ الأيزوبروبانول). اجمع كل الكسور وراقب الشطف عند 280 نانومتر. كميات صغيرة (< 1 مجم) يمكن تنقية مع HPLC-HIC تحت الظروف الموضحة في 2.4 لزيادة العائد والنقاء.
   11. قم بتجميع الكسور التي تحتوي على أجسام مضادة ، وتخفيفها إلى 4 مل على الأقل باستخدام PBS ، وتركيزها عن طريق ترشيح الطرد المركزي وتبادل المخزن المؤقت ثلاث مرات باستخدام PBS.
3. تحديد الجسم المضاد
   1. احصل على تركيز تقريبي عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي ذو الحجم الصغير.
   2. إذا كان القياس الدقيق مطلوبا ، فاستخدم مجموعة ELISA لقياس IgG البشري. للحصول على تقدير تقريبي ، استخدم SDS-PAGE مع صبغة أساسها كوماسي على النحو التالي:
      1. قم بإعداد المعايير عن طريق تخفيف معيار trastuzumab ستة أضعاف القياسي بواسطة ELISA عند 1 مجم / مل.
      2. قم بغلي المعايير والعينات عند حوالي 0.25 مجم / مل في تقليل التحميل العازل.
      3. قم بتشغيلها في 4-12٪ Bis-Tris SDS-PAGE باستخدام المخزن المؤقت MES-SDS وصمة عار بصبغة أساسها Coomasie. أخيرا ، قم بقياس كثافة اللون للنطاق المقابل للضوء أو السلسلة الثقيلة باستخدام ImageJ واستيفاء الإشارة من العينات في المنحنى القياسي.
4. قم بتخزين الجسم المضاد عند 4 درجات مئوية.

< p class = "jove_title" >2. اقتران الجسم المضاد وتوصيف ADC

1. اقتران الجسم المضاد مع الجزيء الحامل للتيترازين
   1. تمييع 10 مكافئات مولارية من التيترازين-vcMMAE (4 ميكرولتر ، 3.4 ملي مولار في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)) مع 20 ميكرولتر من الأسيتونيتريل و 76 ميكرولتر من PBS في أنبوب مخروطي صغير (على سبيل المثال ، أنبوب PCR).
   2. أضف 1 مكافئ مولاري من trastuzumab (CypK) ₂ (100 ميكرولتر ، 2 مجم / مل في PBS) ، واخلطه جيدا ، واتركه يتفاعل لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لتكوين trastuzumab (MMAE) ₂.
      ملاحظه: يمكن ربط جزيئات أخرى مثل tetrazine-5-TAMRA بالجسم المضاد بدلا من tetrazine-vcMMAE باستخدام هذا البروتوكول.
2. تنقية ADC
   1. قم بموازنة عمود دوران استبعاد الحجم مسبقا باستخدام PBS باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
   2. أضف الحجم الكامل للتفاعل على عمود الدوران وجهاز الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة 1 دقيقة.
3. تحديد كمية ADC وتحليل المترافق بواسطة SDS-PAGE
   1. حدد كمية ADC كما هو موضح في 1.3.2. عن طريق قياس كثافة لون السلسلة الضوئية على SDS-PAGE باستخدام الجسم المضاد غير المعدل للمنحنى القياسي.
   2. يجب أن تكون السلسلة الثقيلة قد تحولت قليلا مما يدل على زيادة في الوزن الجزيئي عند الاقتران.
      ملاحظة: إذا تم تعديل الجسم المضاد باستخدام فلوروفور كما هو الحال في trastuzumab (TAMRA) ₂ ، فيجب أن يظهر الشريط المقابل للسلسلة الثقيلة فقط مضان داخل الهلام قبل تلطيخه.
4. تحليل المترافق بواسطة HPLC-HIC
   1. موازنة عمود HPLC-HIC مع 100٪ المخزن المؤقت A (1.5 م (NH₄)₂SO₄, 50 مللي فوسفات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.0, 5٪ الأيزوبروبانول) لمدة 5 دقائق.
   2. امزج 15 ميكرولتر (67 ميكرولتر) من محلول 1 مجم / مل من trastuzumab (CypK) 2 مع 15 ميكرولتر من 2x buffer A في قارورة. ثم قم ببرمجة حقن 10 ميكرولتر في HPLC.
   3. قم بتدفق متساوي 1 مل / دقيقة مع 100٪ مخزن مؤقت A لمدة دقيقة واحدة متبوعا بتدرج 15 دقيقة من 100 إلى 0٪ من المخزن المؤقت A في B (50 ملي مولار ، درجة الحموضة من فوسفات الصوديوم 7.0 ، 20٪ إيزوبروبانول). راقب الشطف عند 280 نانومتر.
   4. احسب DAR عن طريق دمج الذروة المقابلة لكل نوع واستخدام المناطق الناتجة في المعادلة التالية:
      DAR = (1x trastuzumab (MMAE) + 2x trastuzumab (MMAE) ₂)
      /(trastuzumab(MMAE)₀ + trastuzumab(MMAE)₁ + trastuzumab(MMAE)₂)
      وقت الاحتفاظ المتوقع ل trastuzumab (CypK) ₂ هو 7.5-8.0 دقيقة ، وبالنسبة ل trastuzumab (CypK ، MMAE) هو 9.1-9.6 دقيقة ، وبالنسبة ل trastuzumab (MMAE) ₂ هو 10.5-11.0 دقيقة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Expi293F ثيرموفيشر العلمي أ 14527 خلايا تعليق HEK Expi293 التعبير المتوسط ثيرموفيشر العلمي A1435101 وسيط التعبير مضاد حيوي مضاد للفطريات ثيرموفيشر العلمي 15240062 البنسلين - ستربتومايسين - أمفوتريسين ب 125 مل قارورة بولي كربونات Erlenmeyer مع غطاء تهوية كورنينج 431143 قوارير رج حاضنة برونزويك S41i إيبندورف S41I230011 حاضنة CO2 مع شاكر هيدروكسيد الصوديوم 4 مول / لتر (4 نيوتن) في محلول مائي VWR 191373م سيكلوبروبين ليسين سيكيم الطراز SC-8017 في هذه الدراسة تم تصنيعه كما هو موضح من قبل Elliot et al. 2014 Steriflip-GP ، 0.22 ميكرومتر ، بولي إيثر سلفون ، مشع جاما ميرك ميليبور SCGP00525 Opti-MEM ، مصل متوسط مخفض ثيرموفيشر العلمي 31985070 وسط مصل مخفض طقم التعداء ExpiFectamine 293 ثيرموفيشر العلمي أ 14525 كاشف التعداء 5810 R أجهزة الطرد المركزي إيبندورف 5811000460 وحدة فلتر حقنة Millex-GP ، 0.22 ميكرومتر ، بولي إيثر سلفون ، 33 مم ، معقم جاما ميرك ميليبور SLGP033RS راتنج البروتين أ سينو بيولوجي 10600-P07E-RN-25 أعمدة كروماتوغرافيا Poly-Prep ، Pkg من 50 بيو راد 7311550 عمود كروماتوغرافيا البولي بروبلين قمع عمود الاقتصاد بيو راد 7310003 سترات الصوديوم فلوكا 71635 ÄKTA explorer FPLC جنرال إلكتريك للرعاية الصحية طقم اختيار HiTrap HIC جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 28-4110-07 يتضمن HiTrap 1 مل بوتيل HP كبريتات الأمونيوم VWR 2133.296 إيزوبوبانول هونيويل 34863-2.5 لتر ثنائي ميثيل سلفوكسيد سيجما ألدريتش D8418-50ML تيترازين-vcMMAE كيم بارتنر - كوستوم مركبة تيترازين -5-تمرة جينا بيوساينس CLK-017-05 NuPAGE 4-12٪ جل Bis-Tris 1.0 مم × 10 بئر ثيرموفيشر ساينتفيكي NP0321BOX Xcell SureLock Mini-Cell ثيرموفيشر ساينتفيكي EI0001 UltiMate 3000 HPLC ثيرموفيشر ساينتفيكي Thermo Scientific MAbPac ، HIC-20 ، 4.6 × 100 مم ، 5 ميكرومتر ثيرموفيشر ساينتفيكي 88553 NanoAcquity المياه مصل بشري سيجما ألدريتش H4522-20 مل حاضنة CO2 باناسونيك مونوميثيل أوريستاتين إي كايمان للكيماويات 16267 [16267] [م] نانو دروب 2000 ثيرموفيشر ساينتفيكي مقياس الطيف الضوئي الصغير الحجم أنتانت بلو إكسبيدون ISB1L وصمة عار القائمة على كوماسي أنبوب 50 مل ، 114 × 28 مم ، PP سارستيدت 62.547.254 أنبوب مخروطي وحدات تصفية الطرد المركزي Amicon Ultra-15 50,000 NMWL ميرك UFC905024 مكثف ترشيح الطرد المركزي (بعد سحب البروتين أ) وحدات تصفية الطرد المركزي Amicon Ultra-4 50,000 NMWL ميرك UFC805024 مكثفات الترشيح بالطرد المركزي (بعد تنقية FPLC أو HPLC) أعمدة تحلية زيبا تدور ، 7K MWCO ، 0.5 مل ثيرموفيشر ساينتفيكي 89882 أعمدة الدوران لاستبعاد الحجم أنبوب PCR 0.2 مل غطاء مسطح الشوك العلمية المحدودة AX-PCR-02-C-CS أنابيب PCR