مقالة منهجية

الكروماتوغرافيا لاستبعاد حجم الكشف عن التألق: تقنية لتحديد سلامة بروتينات الغشاء الفلوري عند إذابة المنظفات

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: Bird ، L. E. ، et al. فحص التعبير القائم على البروتين الفلوري الأخضر لبروتينات الغشاء في الإشريكية القولونية. J. Vis. Exp. (2015)

في هذا الفيديو ، نعرض تقنية كروماتوغرافيا استبعاد حجم الكشف عن التألق للكشف عن استقرار البروتين الغشائي المنصهر بالبروتين الفلوري الأخضر (GFP) في الإشريكية القولونية بعد إذابة المنظفات. تشير البروتينات التي تظهر ذروة متناظرة في ملف تعريف استبعاد الحجم مع القليل من GFP الحر أو معدومه إلى بروتينات منقاة مع الحد الأدنى من التدهور والتجميع ، والتي يمكن اختيارها لاحقا لتحليل وظيفة الهيكل.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1.الذوبان وتحليل جزء الغشاء

  1. قم بإذابة جزء الغشاء (إذا لزم الأمر) ، ولكل منظف يتم استخدامه للذوبان ، قم بنقل 900 ميكرولتر من معلق الغشاء في أنبوب طرد مركزي دقيق متعدد الألومر سعة 1.5 مل.
  2. أضف 100 ميكرولتر من كل منظف طازج (10٪ وزن / حجم محاليل DDM و DM و Cymal-6 و LDAO) إلى تركيز نهائي قدره 1٪ إلى أنبوب 1.5 مل المحدد. لإذابة بروتينات الغشاء حقيقيات النواة ، يمكن إضافة الكوليسترول هيميسوكسينات (تركيز نهائي 0.2٪) إلى المنظفات.
  3. احتضان الخلطات عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة مع تحريك خفيف.
  4. قم بتكبيل جزء المنظف غير القابل للذوبان باستخدام جهاز طرد مركزي فائق الطاولة ، مما يضمن أن الأنابيب نصف ممتلئة على الأقل ، عند 150,000 جم عند 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة واحتفظ بالمادة الطافية
    ملاحظه: يمكن تقدير فعالية إذابة المنظفات باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت عن طريق قياس مضان GFP للأغشية القابلة للذوبان مع جزء المنظف غير القابل للذوبان المعلق في نفس حجم PBS.
  5. تحليل التشتت الأحادي للمنظفات المختلفة: مجمعات البروتين الغشائي باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم المكتشفة بالفلورة (FSEC).
  6. بالنسبة لتحليل FSEC ، قم بموازنة عمود استبعاد الحجم بنطاق تجزئة واسع ، على سبيل المثال ، 5,000 إلى 5,000,000 في الوزن الجزيئي ، مع تشغيل المخزن المؤقت (20 ملي مولار ثلاثية الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.03٪ DDM) بمعدل تدفق 0.3 مل / دقيقة. استخدم هذا المخزن المؤقت لجميع العينات ، أي أنه لا يتم تغييره لكل منظف تم اختباره.
  7. حقن 100 ميكرولتر من الأغشية القابلة للذوبان على العمود بمعدل تدفق 0.3 مل / دقيقة. مراقبة ملف الشطف باستخدام بصريات التألق (الإثارة عند 488 نانومتر والانبعاث عند 512 نانومتر). إذا لم يكن جهاز مراقبة التألق المضمن متاحا ، فقم بجمع الكسور وقراءة التألق في قارئ لوحة.
  8. قم باستيراد بيانات حجم الشطف وشدة التألق إلى برنامج جداول بيانات للعرض الرسومي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الكوليسترول هيميسوكسينات سيجما ألدريتش ج 6512 سيمال-6 (6-سيكلوهكسيل-1-هيكسيل-بيتا-د-مالتوسيد) أناتيس سي 326 DDM (ن-دوديسيل β-مالتوسيد) جنيرون د97002 DM (ن-ديسيل β-مالتوسيد) جنيرون د99003 LDAO (N,N-ثنائي ميثيل-ندوديسيلامين N-أكسيد) جنيرون د71111 معيار البروتين الفلوري BenchMark تقنيات الحياة ال سي 5928 جهاز طرد مركزي فائق Optima L-100 يعمل بدوار 45-Ti بيكمان كولتر 393253 جهاز طرد مركزي فائق Optima Max-XP يعمل بدوار TLA-55 بيكمان كولتر 393315 بارز UFLC مع كاشف مضان RF-20A شيمادزو عمود استبعاد حجم Sepharose 6 10/300 GL جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-5172-01

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GFP GFP Escherichia coli

مقالات ذات صلة