كروماتوغرافيا التقارب المستندة إلى DFE: تقنية لتنقية الأجسام المضادة أحادية النسيلة 2F5 من عينة خام باستخدام ظروف شطف قائمة على القوة الأيونية العالية

Abstract

المصدر: Knödler، M. et al.، Activated Agarose المتشابك من أجل التطور السريع لراتنجات كروماتوغرافيا التقارب - التقاط الأجسام المضادة كدراسة حالة. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو تقنية كروماتوغرافيا التقارب لتنقية الأجسام المضادة أحادية النسيلة 2F5 باستخدام روابط DsRed-2F5-Epitope أو DFE. الأجسام المضادة أحادية النسيلة 2F5 المنقاة هي أدوية أساسية في العلاج المناعي.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. اختبار تنقية mAbs من مستخلصات النباتات المصفاة

1. تحضير 100 مل من المستخلص النباتي المصفى الذي يحتوي على 2F55 أو المادة الطافية من نظام التعبير الخلوي المفضل ، والذي يحتوي أيضا على 2F5.
2. تحضير مخزن مؤقت للتوازن (20 ملي مولار فوسفات الصوديوم ، 500 ملي كلوريد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 7.4) ، محلول شطف منخفض الأس الهيدروجيني (0.05 ميلار سترات ، 0.05 مولار كلوريد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 4.0-3.25) ، ومحلول شطف عالي القوة الأيونية (1.0-4.0 مولار كلوريد المغنيسيوم ، 0.1 مولار هيبس ، درجة الحموضة 8.0)
3. اغسل نظام الكروماتوغرافيا بالمخازن المؤقتة. قم بتركيب عمود تقارب DFE (راجع نص البروتوكول الرئيسي) على نظام الكروماتوغرافيا وقم بالتوازن مع 5 سيرة ذاتية من المخزن المؤقت للتوازن بمعدل تدفق 1.0 مل ^{في الدقيقة -1}. راقب امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر
   ملاحظه: يمكن أن يؤدي تحميل مستخلص النبات أو المادة الطافية لزراعة الخلايا على العمود إلى زيادة الضغط الخلفي. قم بتعيين تنبيه الضغط العالي عند 0.2 ميجا باسكال لتجنب تلف نظام الكروماتوغرافيا أو عمود DFE.
4. قم بتحميل 80 مل من مستخلص النبات المصفى أو المادة الطافية (الخطوة 1.1) على العمود بمعدل تدفق 0.5 مل في الدقيقة -1 لضمان وقت تلامس يبلغ 2 دقيقة. اجمع عينات التدفق في كسور 2 مل لإعادة بناء منحنى الاختراق. قم بتخزين العينات المتدفقة في درجة حرارة 4 درجات مئوية إذا لم يكن التحليل الفوري للعينة ممكنا.
5. اغسل العمود ب 6 سيرة ذاتية من المخزن المؤقت للتوازن. اجمع عينة من الغسيل في بداية هذه الخطوة ومنتصفها ونهايتها.
6. Elute mAb 2F5 مع 5 سيرة ذاتية من المخزن المؤقت للشطف منخفض الأس الهيدروجيني أو المخزن المؤقت للشطف عالي القوة الأيونية (0.1 M HEPES ، 1.25 M كلوريد المغنيسيوم ، درجة الحموضة 8.0). اجمع كسر DFE عندما تزداد إشارة الأشعة فوق البنفسجية 280 نانومتر إلى 5 مللي فلزات فوق خط الأساس.
   1. تحسين المخزن المؤقت للشطف لكل زوج من الأجسام المضادة. بالنسبة إلى 2F5 ، حقق كلوريد المغنيسيوم 1.25 M توازنا مثاليا بين استعادة المنتج واستقرار الترابط.
      ملاحظه: محلول كلوريد المغنيسيوم عرضة لهطول الأمطار. لذلك ، قم بإذابة كلوريد المغنيسيوم في ~ 700 مل من الماء. قم بإذابة HEPES بشكل منفصل في 100 مل من الماء واضبط الرقم الهيدروجيني على 8.0. أضف محلول كلوريد المغنيسيوم المذاب إلى محلول HEPES وأضف الماء إلى الحجم النهائي البالغ 1.0 لتر. لا تقم بضبط الرقم الهيدروجيني بعد إذابة كلوريد المغنيسيوم لأن هذا سيؤدي إلى هطول الأمطار.
7. قم بتحليل جميع العينات المأخوذة خلال الخطوات 1.4-1.6 باستخدام طريقة برادفورد ، والرحلان الكهربائي لجل كبريتات الليثيوم دوديسيل - بولي أكريلاميد (LDSPAGE) ، والتحليل الطيفي لرنين البلازمون السطحي (SPR).

Materials