مقالة منهجية

فحص نشاط الإنزيم القائم على كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة: تقنية لتحديد نشاط بيروفوسفوكيناز في المختبر باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Pokhrel, A., et al. A التنقية وفحص النشاط في المختبر ل (p) ppGpp Synthetase من المطثية العسيرة. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو مقايسة إنزيم قائم على الكروماتوغرافيا ذات طبقة رقيقة لتحديد نشاط البيروفوسفوكيناز باستخدام النيوكليوتيدات ذات العلامات الإشعاعية. توفر الطريقة نظرة ثاقبة لتخليق النيوكليوتيدات وتفاعلات نقل الفوسفور.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. فحص نشاط البروتين بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة

  1. تحضير لوحة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC).
    1. تحضير ألواح البولي إيثيلين إيثيلين (PEI) - السليلوز عن طريق الغسيل بالماء منزوع الأيونات. ضع الألواح في حجرة زجاجية بها ماء مقطر مزدوج على عمق ~ 0.5 سم.
    2. اسمح للماء بالهجرة إلى أعلى اللوحة.
      ملاحظة: غسل الألواح ليس ضروريا تماما ، حيث يمكن استخدام الألواح بدونها ، لكن الغسيل يزيد من وضوح الصور الناتجة. يضمن غسل الألواح في اتجاهين عموديين عزل أي ملوثات موجودة في الراتنج في أحد أركان اللوحة (الشكل 1).
    3. أخرج الأطباق من الحجرة الزجاجية واتركها على رف منضدة حتى تجف طوال الليل (12-18 ساعة).
    4. ضع علامة على الألواح الجافة على بعد 2.0 سم من حافة واحدة بقلم رصاص ناعم للإشارة إلى مكان تطبيق العينات على TLC. بالنسبة لعينات 2 ميكرولتر ، ضع عينات لا تقل عن 1.0 سم (الشكل 1) .
      ملاحظة: يسمح هذا بالفصل الواضح بين البقعة المجاورة ، وهو أمر بالغ الأهمية لتقدير الإشارة الكمي. طالما لم يتم خدش راتنج السليلوز ، فإن علامات القلم الرصاص الصغيرة على السطح لن تتداخل مع هجرة المذيبات.
    5. عند التخطيط للتجارب ، اترك دائما بقعة واحدة على كل طبق غير مستخدمة.
      ملاحظة: سيوفر هذا ممر فارغا لقياس العينة (الشكل 1). ستحتوي لوحة TLC مقاس 20 سم على مساحة ل 19 مكانا.
  2. مقايسة نشاط الإنزيم
    1. قم بإعداد مزيج عازل 5x يحتوي على 50 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، و 25 ملي مولار أسيتات الأمونيوم ، و 10 ملي مولار KCl ، و 1 ملي مولار DTT و 0.6 ملي مولار ATP (أدينوزين ثلاثي الفوسفات).
      ملاحظة: يمكن تحضير هذا المزيج بكميات كبيرة وتجميده في 10 ميكرولتر لاستخدامه لاحقا. لا تعرض المزيج لدورات متعددة من التجميد والذوبان.
    2. تحضير تفاعلات فردية تحتوي على 3 ميكرومولار RSH (إنزيمات متجانسة Rel / Spo) ، 1x مزيج عازل ، 0.6 ملي مولار ناتج محلي (ثنائي فوسفات غوانوزين) ، 1.2 ملي مولار MgCl2. أضف 1.0 ميكروCi من γ-32P-ATP (ATP الموسوم بالإشعاع) لكل 10 ميكرولتر من التفاعل واستخدم الماء الخالي من النوكلياز لرفع التفاعل إلى الحجم المطلوب. أضف RSH بعد خلط المكونات الأخرى ، حيث أن إضافة RSH إلى المزيج المحتوي على النيوكليوتيدات يبدأ مقايسة النشاط الأنزيمي.
      ملاحظة: يعتمد حجم التفاعل النهائي على عدد النقاط الزمنية التي تم أخذ عينات منها. لأخذ عينات من 2 ميكرولتر/نقطة زمنية، قم بتجميع 10 ميكرولتر من خليط التفاعل لكل 4 نقاط زمنية.
    3. للتحكم في التحلل المائي ل ATP من نشاط النوكلياز الملوث ، قم بتجميع تفاعل 10 ميكرولتر لا يحتوي على بروتين واحتضانه بالتوازي. ضع عينات من 2 ميكرولتر عند t = 0 وفي نهاية التجربة للتأكد من أن ATP لم يتم تحلله في حالة عدم وجود بروتين.
    4. فور إضافة RSH ، قم بإزالة 2 ميكرولتر ووضعها على لوحة السليلوز PEI المسمى مثل عينة t = 0 دقيقة.
    5. احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية ، وإزالة 2 ميكرولتر من الحصص في النقاط الزمنية المطلوبة.
      ملاحظة: سيتوقف النشاط الأنزيمي عندما يتم امتصاص العينة على صفيحة السليلوز. انتظر 10-30 دقيقة بعد إضافة آخر بقعة إلى اللوحة قبل التطوير لضمان الامتزاز الكامل وتجفيف العينة.
  3. كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة
    1. املأ غرفة الكروماتوغرافيا ب 1.5 م 1.5 م KH2PO4 (درجة الحموضة 3.64) على عمق 0.5 سم
      ملاحظة: يعتمد الحجم المطلوب على أبعاد خزان الكروماتوغرافيا. يمكن استخدام أي حاوية زجاجية ذات قاع مستو عريض بما يكفي للسماح بإدخال لوحة TLC دون الانحناء كخزان تطوير مع إضافة غطاء. يمكن تقطيع لوحة TLC إلى شرائح أضيق باستخدام شفرة حلاقة نظيفة لتمكين التطوير في دورق زجاجي مغطى بغشاء بلاستيكي.
    2. اغمر الحافة السفلية للوحة في المذيب. اسمح للمذيب بالهجرة إلى أعلى اللوحة (~ 90 دقيقة).
      ملاحظة: في حين أن هجرة المذيبات ستتوقف في الجزء العلوي من اللوحة ولن تفقد العينات أو تعمل معا أثناء الغمر لفترة أطول ، لا ينبغي ترك الألواح في مذيب طوال الليل. يمكن أن تتسبب الغمرات التي تزيد عن 4 ساعات في انفصال الراتنج عن دعامة اللوحة وتؤدي إلى فقدان الإشارة.
    3. قم بإزالة اللوحة من خزان الكروماتوغرافيا وضعها على رف تجفيف على الطاولة.
    4. اترك الطبق يجف في الهواء طوال الليل.
      ملاحظة: يمكن تسريع التجفيف باستخدام مجفف الشعر. يمكن تقييم الجفاف من خلال لون الراتنج ، والذي سيغمق عندما يكون رطبا ويعود إلى لون اللوحة غير المستخدمة عندما يجف تماما.
    5. بعد أن تجف اللوحة ، لف اللوحة بغشاء بلاستيكي لتجنب نقل المواد المشعة إلى كاسيت التصوير وتحليلها بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي (الشكل 2).
  4. تحليل البيانات
    1. قم بتعريض صفيحة السليلوز PEI التي تحتوي على تفاعلات منفصلة إلى كاسيت فوسفوريجر لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: هذا هو التعرض الكافي للحصول على صورة واضحة جدا باستخدام التركيزات المشار إليها من γ-32P-ATP الطازجة. إذا تم استخدام كميات أقل من الركيزة ذات العلامات الراديوية ، فيمكن زيادة وقت التعرض إلى 12-16 ساعة.
    2. صور الكاسيت على جهاز تصوير الفوسفور.
    3. باستخدام برنامج التصوير مع واجهة مستخدم رسومية ، ارسم مناطق الاهتمام (ROIs) عن طريق تحديد رسم المستطيل واستخدام الماوس لرسم عائد استثمار مستطيل حول ممر واحد كامل وبقع ATP و ppGpp (Guanosine tetraphosphate) الموجودة داخل هذا الممر (الشكل 2).
    4. استخدم أوامر التحديد والنسخ واللصق (أو الأوامر المقابلة بناء على برنامج التصوير المستخدم) لرسم عائد استثمار متطابق داخل الممرات الأخرى للتأكد من أن عائد الاستثمار يقيس الإشارة داخل مناطق متطابقة في كل حارة. قم بتضمين عائد الاستثمار من حارة غير مستخدمة، لاستخدامها كفراغات.
    5. استخدام التحليل | أدوات | مدير العائد على الاستثمار | أضف أوامر برنامج التصوير ، وحدد جميع عائد الاستثمار المرسوم على لوحة السليلوز PEI.
    6. استخدام التحليل | تعيين القياسات | قم بقياس الأوامر ، وحدد كثافة الإشارة داخل كل عائد استثمار وقم بتصدير القياسات كجدول بيانات (الشكل 2). اطرح قيم عائد الاستثمار الفارغة من الإشارات التجريبية.
      figure-protocol-1
    7. احسب النسبة المئوية للإشارة الفارغة داخل كل حارة التي تعزى إلى ATP و ppGpp باستخدام الصيغ.
      ملاحظة: يمكن سحب عائد الاستثمار وتحديده كميا باستخدام برنامج تجاري متوافق مع الفوسفور أو برنامج ImageJ المتاح مجانا (المعاهد الوطنية للصحة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" >figure-results-1
الشكل 1: تحضير لوحات TLC. (أ) يتم غسل الألواح في بعد واحد عن طريق وضع الحافة السفلية في الماء (الأزرق). تهاجر الملوثات (الصفراء) إلى أعلى اللوحة مع المذيب. (ب) بعد تجفيف الصفيحة تماما ، يتم غسلها في بعد ثان عن طريق تدويرها 90 درجة بالنسبة للغسيل الأول والسماح للماء بالهجرة مرة أخرى إلى أعلى اللوحة. (ج) بعد الغسيل ، يتم عزل أي ملوثات في أحد أركان اللوحة. يمكن تمييز راتنج لوحة TLC المغسولة برفق بقلم رصاص ناعم ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خزان تطوير الكروماتوجراف ذو الطبقة الرقيقة (TLC) الشركة العامة لنفخ الزجاج 80-3 ألواح البولي إيثيلينيمين (PEI) - السليلوز (20 سم × 20 سم ، سمك 100 ميكرومتر) مع دعم البوليستر سيجما ألدريتش Z122882-25 إيه ATP ، [γ-32P] - 3000 Ci / mmol 10mCi / مل من الرصاص ، 100 ميكرو Ci بيركين إلمر NEG002A الأدينوزين 5'-ثلاثي الفوسفات (ATP) 100 ملي مولار بيو بيسك كندا أ ب0311 ملح ثنائي الصوديوم جوانوزين 5 '-ثنائي الفوسفات (الناتج المحلي الإجمالي) ألفا إيسار AAJ61646MC / ه شاشة تخزين الفوسفور جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة شاشة BAS-IP TR 2040 E Tritium العاصفة 860 فوسفوريجر جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة -

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Thin Layer ChromatographyEnzyme Activity AssayPyrophosphokinase ActivityRadiolabeled ATPGuanosine TetraphosphatePEI Cellulose PlateAutoradiography AnalysisPhosphorimager ImagingReaction Mixture PreparationTime Point Sampling

مقالات ذات صلة