$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة عالية الأداء (HPTLC) لنصف كمية كمية العديد من الدهون ، بما في ذلك الكوليسترول والفوسفوليبيدات والسفينجوميلين
- قم بإعداد حلول التشغيل الأربعة التالية ومحاليل التلوين.
- الحل 1: اخلطي أسيتات الإيثيل (26.6٪) ، 1-بروبانول (26.6٪) ، الكلوروفورم (26.6٪) ، الميثانول (26.6٪) ، وكلوريد البوتاسيوم (9.6٪). تحضير KCl عن طريق إذابة 0.25 جم من KCl في 100 مل من الماء بجودة HPLC.
- الحل 2: اخلطي n-hexane (73٪) ، ثنائي إيثيل الأثير (23٪) ، وحمض الستريك (2٪).
- الحل 3: 100٪ n-hexane.
- تحضير محلول التلوين عن طريق خلط الماء المقطر (90 مل) مع 7.5 غرام من كبريتات النحاس ، ثم إضافة 10 مل من حمض الفوسفوريك.
- املأ ما يصل إلى 5 مم من كل محلول في حجرة زجاجية منفصلة. أضف أي نوع من ورق الترشيح لزيادة سرعة التشغيل في كل غرفة.
قم - باحتضان صفيحة زجاجية HPTLC هلام السيليكا 60 مقاس 20 × 10 سم مسبقا في محلول التشغيل الأول حتى يصل محلول التشغيل إلى أعلى اللوحة. ثم جففه لمدة 10 دقائق عند 110 درجة مئوية.
ملاحظه: يمكن تخزين هذه الألواح للاستخدام المستقبلي في رقائق الألومنيوم وتجفيفها لمدة 10 دقائق عند 110 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- قم بإذابة حبيبات دهنية تم الحصول عليها من العدلات المشتقة من الدم المحيطي البشري في 200 ميكرولتر من محلول الكلوروفورم / الميثانول (1: 1) واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتذوب.
- استخدم مسطرة وقلم رصاص ناعم لتمييز نقاط التحميل للعدد المطلوب من العينات ، بالإضافة إلى معيار واحد على الأقل. حدد مسافة الجري عند حوالي 4 سم و 6 سم لحل التشغيل الأول والثاني ، على التوالي.
- لتحميل العينات ، اغسل المحقنة سعة 10 ميكرولتر 3 مرات في الكلوروفورم / الميثانول (1: 1) قبل تحميل كل عينة جديدة. قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل عينة من حيث القطرة ، محاولا تركيز العينة على مساحة صغيرة قدر الإمكان. يجب تحميل العينات على الأقل في نسخ مكررة.
- ضع اللوحة عموديا في الغرفة الأولى مع المحلول قيد التشغيل 1 (الخطوة 1.1.1). تأكد من أن اللوحة موازية لجدار الغرفة الزجاجية لتحقيق سرعة ترحيل موحدة.
- بمجرد وصول خط المذيب إلى العلامة الأولى ، قم بإزالة اللوحة وجففها وضعها في المحلول الثاني. كرر خطوات مماثلة للحلول الثانية والثالثة قيد التشغيل ؛ اترك اللوحة في المحلول حتى تصل مقدمة المذيب إلى الجزء العلوي من اللوحة ، ثم قم بإزالتها وجففها في RT لمدة 1 دقيقة.
- ضع الطبق في محلول كبريتات النحاس لمدة 7 ثوان ، قم بإزالة الطبق وجففه جيدا واخبزه في فرن لمدة 7 دقائق عند 170 درجة مئوية. انتظر حتى يبرد الطبق.
- باستخدام برنامج تحليل الكروماتوغرافيا والهلام ذو الطبقة الرقيقة ، بالإضافة إلى برنامج معالجة الصور ، قم بالمسح والتحليل لتحديد نطاقات الدهون التي تم حلها.