الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد: تقنية تحليلية للكشف عن كبريتات الهيباران ذات أطوال السلسلة المتفاوتة المعزولة من أنسجة رئة الفأر

الملخص

المصدر: LaRiviere ، WB et al. ، الكشف عن الجليكوزامينوجليكان عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد وتلوين الفضة. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو إجراء فصل كبريتات الهيباران المعزولة من أنسجة رئة الفأر باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد.

البروتوكول

فئة

1. الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد للجليكوزامينوجليكان المعزول والنقي

1. قم بإعداد المحاليل اللازمة للرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد (PAGE) مسبقا (الجدول 1). < / > ملاحظه: حدد النسبة المئوية للأكريلاميد لمحلول الهلام المذاب اعتمادا على حجم الجليكوزامينوجليكان المتوقع أن تكون في العينة. يوصى بنسبة 15٪ لحل الشظايا الأكبر حجما (أكبر من 30 وحدة فرعية ثنائية السكاريد في الطول) ؛ 22٪ للشظايا الأصغر (<20 وحدة فرعية ثنائية السكاريد في الطول).
2. ضع الكاسيت الفارغ في خزان PAGE. صب الجل القابل للحل على النحو التالي: في أنبوب سعة 15 مل ، امزج 10 مل من محلول الجل المذاب ، و 60 ميكرولتر من بيرسلفات الأمونيوم بنسبة 10٪ (يجب تحضيره طازجا) ، و 10 ميكرولتر من TEMED (أضف TEMED أخيرا). اقلب الأنبوب برفق 2-3x. استخدم الماصة لإضافة محلول 10 مل أعلاه بسرعة إلى الدرج. تراكب ب 2 مل من الماء منزوع الأيونات والمرشح والسماح للجل القابل للبلمرة لمدة 30 ><دقيقة. ملاحظه: تم تحسين بروتوكول PAGE التالي لنظام PAGE الرأسي باستخدام أشرطة صب بسمك 13.3 × 8.7 سم (العرض × الطول) 1.0 مم بحجم إجمالي يبلغ حوالي 12 مل. يمكن استخدام أنظمة كاسيت أخرى ولكنها قد تتطلب التحسين من قبل المستخدم النهائي.
3. بعد بلمرة جل المحلول بالكامل ، تخلص من الماء المتراكب وصب جل التكديس على النحو التالي: في أنبوب سعة 15 مل ، امزج 3 مل من محلول هلام التكديس ، 90 ميكرولتر من بيرسلفات الأمونيوم بنسبة 10٪ (يجب تحضيره طازجا) ، 3 ميكرولتر من TEMED (أضف TEMED أخيرا).
4. اقلب الأنبوب برفق 2-3x. استخدم ماصة لإضافة محلول هلام التكديس بسرعة فوق جل التسوية المتصلب. املأ الكاسيت حتى أسنانه. أدخل المشط بالكامل المضمن في الإعداد. اترك جل التكديس يتبلمر لمدة 30 دقيقة.
5. بمجرد بلمرة الجل ، تأكد من إزالة شريط الشريط من أسفل الكاسيت ، ثم ضع الكاسيت مرة أخرى في مجموعة خزان PAGE.
6. املأ الغرف العلوية والسفلية بمخزن مؤقت للغرفة العلوية والسفلية ، على التوالي.
7. قم بإذابة العينات المجففة من الخطوة 1.11.4 في الحد الأدنى من الحجم اللازم للمياه المنزوعة الأيونات والمفلترة (على الأكثر ، 50٪ من حجم الآبار في هلام PAGE). امزج 1: 1 مع المخزن المؤقت لتحميل العينة. قم بتحميل العينات و "سلالم" قليل السكاريد HS (انظر الجدول 1) في الجل.
8. قم بتشغيل الجل مسبقا لمدة 5 دقائق عند 100 فولت. ثم قم بتشغيل الجل على حرارة 200 فولت لمدة 20-25 دقيقة (للحصول على جل لحل بولي أكريلاميد بنسبة 15٪) ، 40-50 دقيقة (لجل حل بولي أكريلاميد بنسبة 18٪) ، 90-100 دقيقة (لجل حل بولي أكريلاميد بنسبة 22٪).
   ملاحظه: قد يكون من الضروري بعض التحسين لوقت التشغيل 200 فولت. يهاجر الفينول الأحمر قبل السكريات قليلة السكاريد الهيبارين التي يبلغ طولها وحدتان فرعيتان من البوليمر (أي درجة البلمرة 2 ، أو dp2) ؛ يهاجر بروموفينول الأزرق قبل DP10-DP14. يتم الحصول على أفضل النتائج عند تطبيق الجهد بحيث يهاجر شريط الفينول الأحمر تقريبا ، ولكن ليس تماما ، إلى قاع الجل. اضبط وقت التشغيل وفقا لذلك.

النتائج

< p class = "jove_content">الجدول 1: المحاليل المطلوبة للرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد للجليكوزامينوجليكان المنقى. يجب تصفية جميع المحاليل (0.22 ميكرومتر) قبل الاستخدام.

ملاحظة: يجب تصفية جميع المحاليل (0.22 ميكرومتر) قبل الاستخدام. حل وصفة تكوين

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات بيرسلفات الأمونيوم (صلب) ثيرموفيشر العلمي ص179-25 درجة الرحلان الكهربائي نظام تنقية المياه Barnstead GenPure Pro ثيرموفيشر العلمي 10-451-217 بكلوغرام أي نظام لإزالة الأيونات / تنقية المياه هو بديل مقبول حمض البوريك (صلب) ثيرموفيشر العلمي أ 73-500 درجة البيولوجيا الجزيئية برومفينول أزرق (صلب) ثيرموفيشر العلمي ب 392-5 معيار كاسيت فارغ ل PAGE (سمك 1.0 مم ، 12 + 2 آبار) بيو راد 3459901 يكفي أي نظام كاسيت صب PAGE بسمك 1.0 مم نظام خلية المعيار PAGE (الخلية وإمدادات الطاقة) بيو راد 1656019 سيعمل أي نظام PAGE عمودي مماثل للهلام) ملح ثنائي الصوديوم EDTA (صلب) ثيرموفيشر العلمي 02-002-786 درجة البيولوجيا الجزيئية جلايسين (صلب) ثيرموفيشر العلمي جي 48-500 درجة الرحلان الكهربائي حمض الهيدروكلوريك (سائل) ثيرموفيشر العلمي أ 466-250 N ، N'-methylene-bis-acrylamide (صلب) ثيرموفيشر العلمي بي ت 171-25 درجة الرحلان الكهربائي الفينول الأحمر (صلب) ثيرموفيشر العلمي ص 74-10 حمض خال السكروز (صلب) ثيرموفيشر العلمي بي ت 220-1 درجة البيولوجيا الجزيئية TEMED (N ، N ، N '، N'-tetramethylenediamine) ثيرموفيشر العلمي بي بي 150-20 درجة الرحلان الكهربائي قاعدة تريس (صلبة) ثيرموفيشر العلمي بي ت 152-500 درجة البيولوجيا الجزيئية وحدة تصفية الفراغ ، للاستخدام الفردي ، 0.22uM المسام PES ، حجم 500 مل ثيرموفيشر العلمي 569-0020 الأحجام البديلة ومواد الترشيح مقبولة أكريلاميد (صلب) ثيرموفيشر العلمي بي بي 170-100 درجة الرحلان الكهربائي ديكاساكاريد مشتق من الهيبارين (dp10) جالينوس العلمية HO10 سداسي الساكارد المشتق من الهيبارين (dp6) جالينوس العلمية هو06 قليل السكاريد المشتق من الهيبارين (dp20) جالينوس العلمية HO20