الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد دوديسيل كبريتات الصوديوم لتحليل البروتين: تقنية لفصل البروتينات وتصورها بناء على الوزن الجزيئي

الملخص

المصدر: Sultana, S. et al. استخراج وتصور مجاميع البروتين بعد علاج الإشريكية القولونية بضغط سام بروتيني. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو تقنية فصل قائمة على بولي أكريلاميد لتغيير طبيعة البروتينات. تساعد هذه التقنية في التحديد الأولي للبروتينات بناء على أوزانها الجزيئية.

البروتوكول

1. فصل وتصور مجاميع البروتين المستخرجة باستخدام SDS-PAGE

1. تحضير جل 12٪ SDS-polyacrylamide
   1. بالنسبة لاثنين من المواد الهلامية المنفصلة ، ماصة 5.1 مل من الماء المقطر المزدوج (ddH₂O) ، 3.75 مل من Tris-HCl (درجة الحموضة 8.8) ، 7.5 مل من 20٪ (وزن / حجم) SDS ، 6 مل من محلول 30٪ أكريلاميد / بيساكريلاميد (29: 1) ، 75 مل من 10٪ وزن / حجم بيرسلفات الأمونيوم ، و 10 مل من رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل واخلطهم برفق دون إدخال فقاعات هواء. صب الجل باستخدام ماصة سعة 1 مل داخل الألواح الزجاجية ، مع ترك الجزء العلوي 2 سم خاليا من الخليط. أضف 70٪ من الإيثانول في الجزء العلوي من الجل المنفصل واسمح بواجهة متساوية بين الطبقتين.
   2. بعد بلمرة جل الفصل ، قم بإعداد جل التكديس عن طريق سحب 1.535 مل من ddH₂O ، و 625 مل من Tris-HCl (درجة الحموضة 6.8) ، و 12.5 مل من 20٪ (وزن / حجم) SDS ، و 335 مل من محلول 30٪ أكريلاميد / بيساكريلاميد (29: 1) ، و 12.5 مل من 10٪ وزن / حجم بيرسلفات الأمونيوم ، و 2.5 مل من TEMED. قم بإزالة الإيثانول من المواد الهلامية المنفصلة وأضف محلول هلام التكديس. أدخل مشطا بالعدد المطلوب من الجيوب دون إدخال فقاعات هواء. اترك البلمرة لمدة 20-30 دقيقة.
2. قم بتحميل 4 ميكرولتر من كل عينة وسلم بروتين في آبار منفصلة وقم بتشغيل الهلام (الجلام) في مخزن مؤقت تشغيل Tris-Glycine (الجدول 1) عند 144 فولت لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: أوقف الجل عندما يكون شريط البروموفينول على وشك الهجرة من الجل.
قم
3. بتلطيخ الجل (الجل) في محلول فيربانكس الدافئ مسبقا أ (الجدول 1) لمدة 30 دقيقة على هزاز.
4. قم بإزالة لون الجل (الجلام) في محلول فيربانكس الدافئ مسبقا D (الجدول 1) حتى الخلفية المرغوبة (على سبيل المثال ، بين عشية وضحاها) على هزاز.

النتائج

محاليل الوصفات المخزن المؤقت أ 10 ملي فوسفات البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني 6.5) ، 1 ملي مولار EDTA العازلة ب المخزن المؤقت A يحتوي على 2٪ Nonidet P-40. يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لاستخدامها لاحقا. فيربانكس أ (محلول تلطيخ) 25٪ إيزوبروبانول ، 10٪ حمض الخليك ال...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات المواد الكيميائية / الكواشف أسيتون فيشر ساينتيك 67-64-1 30٪ محلول أكريلاميد / بيساكريلاميد 29: 1 بيو راد 1610156 بيرسلفات الأمونيوم ميليبور سيجما أ 3678-100 جرام بلوستين 2 سلم بروتين ، 5-245 كيلو دالتون جولد بيو P008-500 β ميركابتو إيثانول ميليبور سيجما M6250-100 مل بروموفينول الأزرق جولد بيو ب -092-25 كوماسي أزرق بريليانت R-250 إم بي بيوميديكالز ذ.م.م 821616 حمض الخليك رباعي الإيثيلين ديامين (EDTA) سيجما ألدريتش SLBT9686 حمض الخليك الجليدي ميليبور سيجما ARK2183-1 لتر الجلسرين ، 99٪ سيجما ألدريتش G5516-1L جلايسين جولد بيو جي 630-1 الأيزوبروبانول (2-بروبانول) سيغما 402893-2.5 لتر 10x MOPS المخزن المؤقت تكنوفا M2101 كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) سيجما ألدريتش L3771-500G رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) ميليبور سيجما تي 9281-50 مل قاعدة تريس جولد بيو تي -400-1 المواد / المعدات مزود الطاقة ثيرموفيشر العلمي إيك 105 الكرسي الهزاز القلويات العلمية RS7235 صفيحة زجاجية صغيرة بيو راد 1653311 لوحات فاصلة (1 مم) بيو راد 1653308 مقياس الطيف الضوئي علم الحرارة 3339053 جهاز طرد مركزي منضدي لأنابيب الطرد المركزي سعة 15 مل بيكمان كولتر غرفة الرحلان الكهربائي للهلام العمودي بيو راد 1658004 دوامة فيشر فورتكس جيني 2 12-812 خلاط حراري المعيار العلمي H5000-HC 10 مشط بئر بيو راد 1653359