تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد اليوريا لتحليل الحمض النووي الريبي: تقنية لفصل قليل النوكليوتيدات الحمض النووي الريبي الفسفرية المسمى بالفلورسنت عن نظيراتها غير الفسفرية

الملخص

المصدر: Pillon ، M. C. ، et al. ، الفحص غير المشع لقياس فسفرة عديد النوكليوتيدات لركائز النيوكليوتيدات الصغيرة. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نوضح الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد متغير الطبيعة لفصل أنواع الحمض النووي الريبي الفسفوري عن نظيراتها غير الفسفرية. يتم تصنيف أنواع الحمض النووي الريبي بالفلورسنت للكشف بالليزر على الجل.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الرحلان الكهربائي للهلام

1. تحضير 15٪ أكريلاميد / 8 M محلول جل اليوريا.
   أنذر: يجب التعامل مع مادة الأكريلاميد بحذر ، لأنه سم عصبي. ارتد دائما القفازات ومعطف المختبر والنظارات الواقية عند التعامل معها.
   1. في دورق زجاجي سعة 150 مل ، امزج 22.5 مل من محلول أكريلاميد / ثنائي أكريلاميد 29: 1 40٪ ، و 6 مل من 10x TBE ، و 28.8 جم من اليوريا ، والماء الخالي من RNase بحجم إجمالي يبلغ 59 مل. حرك المحلول برفق.
      ملاحظه: اعتمادا على طول ركيزة الحمض النووي الريبي ، قد يؤدي تغيير النسبة المئوية لبولي أكريلاميد إلى تحسين الدقة بين الحمض النووي الريبي غير الفسفري والفسفرة.
   2. لإذابة اليوريا ، قم بتسخين المحلول في الميكروويف لمدة 20 ثانية ، وحرك السائل ، ثم ضع المحلول على الفور مرة أخرى في الميكروويف لمدة 20 ثانية أخرى.
   3. قم بتبريد المحلول ببطء عن طريق وضع الدورق الزجاجي في حمام مائي ضحل يحتوي على ماء بارد. تأكد من أن مستوى الماء البارد المحيط بالدورق الزجاجي أعلى من مستوى المحلول داخل الدورق الزجاجي. سيؤدي ذلك إلى تعزيز نقل الحرارة بكفاءة. انتظر 5 دقائق < / > ملاحظه: لا تستمر في هذا البروتوكول إذا كان الدورق الزجاجي دافئا ؛ يجب أن يكون الماء أقل من 25 درجة مئوية. إذا كان لا يزال يشعر بالدفء بعد 5 دقائق ، فاستبدل الماء الموجود في الحمام المائي بالماء البارد العذب وانتظر 5 دقائق أخرى.
   4. قم بتصفية المحلول وتفريغه باستخدام وحدة ترشيح يمكن التخلص منها 0.22 ميكرومتر لإزالة الجسيمات وفقاعات الهواء المجهرية.
2. صب جل تغيير الطبيعة
   1. استخدم الصابون والماء الدافئ لتنظيف لوح زجاجي قصير وطويل مصمم للمواد الهلامية بأبعاد إجمالية تبلغ 31.0 سم × 38.5 سم. رش كل لوح زجاجي بنسبة 95٪ من الإيثانول وامسح الزجاج لإزالة أي رطوبة.
      ملاحظه: يمكن أن يكون أحد اللوحين من السيليكون لمنع تلف الجل عند فصل شطيرة اللوحة الزجاجية. ومع ذلك ، فإن هذه الخطوة ليست ضرورية لأن هذا البروتوكول مصمم لتصور الحمض النووي الريبي دون فصل الألواح الزجاجية.
   2. ضع اللوح الزجاجي الطويل أفقيا فوق الصندوق بحيث يتم رفعه عن سطح الطاولة.
      أنذر: مادة الأكريلاميد سامة ، لذلك يجب تغطية محطة صب الجل بورق مقعد يمكنه امتصاص أي سائل منسكوب ووضعه على الفور في كيس نفايات بعد اكتمال الإجراء.
   3. ضع فاصلا نظيفا بحجم 0.4 مم على طول الحواف الطويلة لللوحة الزجاجية الطويلة.
   4. ضع اللوح الزجاجي القصير فوق اللوحة الطويلة وتأكد من محاذاة حواف اللوحة القصيرة واللوحة الطويلة والفواصل الزمنية. قم بتثبيت كل جانب باستخدام ثلاثة مشابك معدنية متباعدة بشكل متساو.
   5. أضف 24 ميكرولتر من TEMED إلى محلول اليوريا 15٪ من الأكريلاميد / 8 M المحضر في الخطوة 3.1 واخلط المحلول.
   6. أضف 600 ميكرولتر من APS بنسبة 10٪ (وزن / حجم) إلى المحلول في الخطوة 1.2.5 واخلط المحلول برفق.
   7. صب المحلول على الفور بين الألواح الزجاجية.
      ملاحظه: لتجنب الفقاعات ، اضغط على الزجاج أثناء سكب المحلول.
   8. أضف بعناية مشطا نظيفا ، 0.4 مم ، 32 جيدا إلى الجزء العلوي من شطيرة اللوحة الزجاجية.
   9. اترك ما لا يقل عن 30 دقيقة حتى يتبلمر مادة الأكريلاميد.
3. قم بتشغيل جل تغيير الطبيعة
   1. اضبط كتلة الحرارة على 75 درجة مئوية.
   2. قم بإزالة المشابك المعدنية التي تثبت شطيرة اللوحة الزجاجية معا واغسل وجفف شطيرة اللوحة الزجاجية جيدا.
   3. ضع شطيرة اللوحة الزجاجية في جهاز الجل بحيث تكون اللوحة القصيرة متجهة للداخل.
   4. قم بإعداد المخزن المؤقت للتشغيل 0.5x TBE عن طريق الجمع بين 100 مل من 10x TBE مع 1.9 لتر من الماء الخالي من RNase. أضف 600 مل من المخزن المؤقت للتشغيل إلى الغرف العلوية والسفلية لجهاز الجل.
   5. قم بإزالة المشط برفق وشطف الآبار جيدا باستخدام حقنة. ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لإزالة اليوريا من الآبار.
   6. قم بتشغيل الجل مسبقا لمدة 30 دقيقة عند 50 واط ، والجهد حوالي 2,000 فولت تنبيه: يعمل جهاز الجل هذا بقوة كهربائية عالية ويجب على المستخدمين التحلي بالاحتياطات.
   7. اشطف الآبار جيدا باستخدام حقنة.
      ملاحظه: هذه الخطوة ضرورية لتحميل العينة في الآبار.
   نبض
   8. يدور التفاعلات المروية. ثم احتضان الأنابيب عند 75 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. كرر دوران النبض.
   9. قم بتحميل 10 ميكرولتر من العينة على الفور لكل بئر وقم بتشغيل الجل لمدة 3 ساعات عند 50 واط < / > ملاحظه: الحمض النووي الريبي المسمى بالفلورسنت حساس للضوء. لذلك ، قم بتغطية جهاز الجل بورق الألمنيوم.
4. صورة جل تغيير الطبيعة.
   1. قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة واستنزاف الغرفة العلوية لجهاز الجل.
   2. اغسل وجفف الجانب الخارجي من شطيرة الطبق الزجاجي بالماء والصابون. غطي شطيرة الطبق الزجاجي بورق الألمنيوم أثناء نقل الجل.
   3. قم بتركيب شطيرة اللوحة الزجاجية على مسرح ماسح ضوئي ليزر قادر على الكشف الكمي والحساس عن التألق.
      ملاحظه: هذا الجل رقيق للغاية للحصول على أقصى قدر من الدقة. لهذا السبب ، تم تصميم هذا البروتوكول لتجنب صعوبات إزالة الجل من شطيرة اللوحة الزجاجية عن طريق تصور الحمض النووي الريبي المسمى بالفلورسنت مباشرة من خلال الألواح الزجاجية. سيؤدي استخدام الألواح الزجاجية منخفضة التألق المتوفرة تجاريا إلى زيادة الإشارة الملتقطة عن طريق تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
   4. اضبط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث للماسح الضوئي بالليزر للفلوروفور المطلوب.
      ملاحظه: قد تختلف الأطوال الموجية المثلى للإثارة والانبعاث بالنسبة للفلوروفورات المحددة. بالنسبة لفلوروفور FAM ، تبلغ الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث 495 نانومتر و 535 نانومتر على التوالي.
   5. حدد المنطقة المراد تصورها في مرحلة الماسح الضوئي بالليزر وقم بتصوير الجل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (الشكل 1).

النتائج

p class = "jove_content" >
< style قوي = "حجم الخط: 13 بكسل ؛ ">الشكل 1: < span style = "font-size: 13px;" > مثال على تحليل هلام تغيير طبيعة الحمض النووي الريبي الفسفوري. مقايسة كيناز الحمض النووي الريبي في المختبر ل Las1-Grc3 (110 نانومتر) محتضنة ب 500 نانومتر SC-ITS2 RNA. يشير X إلى تفاعل التحكم بدون Las1-Grc3 ويمثل المثلث الأسود معايرة ATP من 0-10 ملي مولار. C2 RNA هو نتيجة انقسا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.4 مم مشط 34 بئر بيورراد 1653848 فاصل 0.4 مم بيورراد 1653812 0.5 م EDTA ph 8.0 دينار كويتي الطبي RGF-3130 1M كلوريد المغنيسيوم دينار كويتي الطبي كاك -5290 1 متر تريس درجة الحموضة 8.0 دينار كويتي الطبي RGF-3360 40٪ محلول أكريلاميد / مكرر 29: 1 بيورراد 1610146 5M كلوريد الصوديوم دينار كويتي الطبي RGF-3720 بيرسلفات الأمونيوم (APS) بيورراد 161-0700 ATP سيغما أ2383-1 جي حمض البوريك سيغما ب 0394 ملح الصوديوم الأزرق بروموفينول سيغما B5525-5G لوحات زجاجية توماس العلمية 1188 ك 51 جهاز التسلسل Hoefer SQ3 هيفر غير متاح برنامج Image J غير متاح غير متاح https://imagej.nih.gov/ij/ قليل النوكليوتيدات الحمض النووي الريبي المسمى آي دي تي طلب مخصص فارماسيا EPS 3500 مزود الطاقة صيدلة غير متاح Steriflip 0. 22 ميكرومتر مرشح ميليبور 5FCP00525 تيميد بيورراد 161-0800 قاعدة تريس سيغما تريس رو تايفون FLA 9500 جل تصوير جنرال إلكتريك للرعاية الصحية غير متاح مياه DEPC فائقة النقاء إنفيتروجين 750023 الجلسرين النقي الفائق إنفيتروجين هاتف: 1056865 يوريا فيشر للكيماويات تحت 15-500