الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز ثنائي الأبعاد شبه المتغير: تقنية لفصل ألياف الأميلويد متعددة الأشكال بناء على عدم تجانس الحجم

الملخص

المصدر: Hanna-Addams، S.، et al. استخدام الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز ثنائي الأبعاد شبه التغيير الطبيعي لتأكيد عدم تجانس حجم ألياف الأميلويد أو الألياف الشبيهة بالأميلويد. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو الفصل القائم على الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد لألياف الأميلويد المنظفات شبه المتمسخة. تفصل هذه التقنية مجاميع الأميلويد متعددة الأشكال بناء على حجمها غير المتجانس.

البروتوكول

1. تحضير العينات

1. مزرعة 2 × 10⁶ أميلويد تنتج خلايا سرطان القولون HT-29 في طبق زراعة أنسجة بطول 10 سم في 10 مل من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني وبنسلين ستربتومايسين. زراعة الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   1. بعد أن تنمو الخلايا إلى 80٪ من التقاء ، اغسل الخلايا ب 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). أضف 3 مل من محلول التربسين واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
   2. بعد فصل الخلايا تماما عن الطبق ، أضف 10 مل من وسط المزرعة وانقل الخلايا بماصة سعة 10 مل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. الطرد المركزي للخلايا عند 1,000 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بشفط الوسط ، وأعد تعليق الخلايا في 5 مل من وسط الثقافة ، وعد الخلايا باستخدام عداد الخلايا. طبق 2 × 10⁶ خلايا في كل من طبقين بطول 10 سم.
   3. اسمح للخلايا بالالتصاق والتعافي طوال الليل في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. قم بتطبيق العلاج على طبق واحد للحث على تكوين الأميلويد باستخدام 20 نانوغرام / مل عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) ، و 100 نانومتر Smac-commetic ، و 20 ميكرومتر مثبط عموم كاسباز Z-VAD-FMK. يتم اختصار المجموعة باسم TSZ. تعامل مع الطبق الآخر مع السيارة كعنصر تحكم.
2. بعد المدة الزمنية المناسبة ، عادة 6 ساعات ، حصاد محللة الخلية.
   1. اكشط الخلايا من اللوحة باستخدام مكشطة بلاستيكية واستخدم ماصة سعة 10 مل لنقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. الطرد المركزي للخلايا عند 1,000 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   2. اغسل الخلايا مرتين عن طريق إعادة تعليقها في 10 مل من PBS المثلج والطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية><. ملاحظه: يمكن إيقاف العملية مؤقتا هنا عن طريق تجميد حبيبات الخلية في النيتروجين السائل وتخزينها عند 80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
   3. انقل حبيبات الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل واحتضانه في 0.3 مل من محلول التحلل لمدة 30 دقيقة على الجليد. جهاز طرد مركزي عند 20,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. المادة الطافية هي محللة الخلية بأكملها.
      ملاحظه: يمكن إيقاف العملية مؤقتا هنا عن طريق تخزين العينة عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أشهر.
   4. قم بقياس تركيز البروتين بواسطة اختبار برادفورد. أضف 4x SDD-AGE المخزن المؤقت للتحميل لتحضير 20 ميكرولتر من عينة 3 ميكروغرام / ميكرولتر واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

< p class = "jove_title" >2. تحضير وتشغيل المواد الهلامية

1. أضف 2 جم من الاغاروز إلى 200 مل من 1x Tris-acetate Buffer (TAE) في دورق زجاجي وقم بتسخينه في الميكروويف لإذابة الاغاروز. أضف 1 مل من 20٪ SDS للحصول على تركيز نهائي قدره 0.1٪ SDS. حرك بحذر للخلط. احرص على عدم إنشاء فقاعات بعد إضافة SDS.
2. صب محلول الاغاروز في لوح جل مقاس 15 سم × 14 سم. استخدم ماصة سعة 1 مل للتخلص من أي فقاعات. ضع مشطا واحدا سعة 20 بئرا في الأعلى.
3. البعد الأول: ماصة 60 ميكروغرام من محللة الخلية بأكملها في أقصى الممر الأيمن. قم بتشغيل الجل عند 60 فولت لمدة 4 ساعات تقريبا (حتى تصبح مقدمة الصبغة حوالي 3/4 من خلال الجل) باستخدام TAE الذي يحتوي على 0.1٪ SDS كمخزن مؤقت للتشغيل.
4. البعد الثاني: قم بتدوير الجل بعناية 90 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة (الشكل 1 أ). قم بتشغيل الجل عند 60 فولت لمدة 4 ساعات < / > ملاحظه: حالة التشغيل العامة هي 4 فولت / سم طول الجل. من المهم أن تكون ظروف التشغيل هي نفسها تماما بالنسبة للبعدين الأول والثاني.

النتائج

p class = "jove_content" >
الشكل 1. البروتوكول التجريبي.(أ) تخطيطي للرحلان الكهربائي لجل الاغاروز ثنائي الأبعاد شبه التغيير (2D SDD-AGE). ابدأ بتحميل العينة في أقصى الممر الأيمن، المسمى باللون الأحمر. بعد إنهاء تشغيل البعد الأول ، قم بتدوير الجل بزاوية 90 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي للبعد الثاني. يشير السهم الصلب إلى اتجاه تشغيل البعد الأول ، ويشير السهم المنقط إلى اتجاه تشغيل البعد الثاني. (ب

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات وحدة الرحلان الكهربائي للهلام صياد HE99XPRO appratus لتشغيل الجل. أجروز VWR 97062-250 لجل الاغاروز. DMEM سيغما د6429 لزراعة الخلايا مصل الأبقار الجنينية سيغما F4135 لزراعة الخلايا البنيسيلين ستربتومايسين سيغما ص 4333 لزراعة الخلايا محلول التربسين سيغما تي 4049 لزراعة الخلايا PBS لزراعة الأنسجة سيغما د8662 لزراعة الخلايا عامل نخر الورم المؤتلف صنع في مختبرنا للحث على تشريح. انظر المرجع 11. SMAC مقلد هدية من الدكتور شياودونغ وانغ للحث على تشريح. انظر المرجع 11. ZVAD-FMK أبيكسبيو أ 1902 للحث على تشريح. انظر المرجع 11. عداد الخلية بيو راد 1450102 نموذج TC20 ؛ لعد الخلايا بيرس™ BCA مجموعة فحص البروتين الترمو: العلمية هاتف: 23225 لقياس تركيز البروتين في محللات الخلايا رافع الخلايا صياد 07-200-364 لإزالة الخلايا من الطبق عازلة التحلل (1 لتر) 20 مل 1 م تريس درجة الحموضة 7.4
10 مل جلسرين
30 مل 5 م كلوريد الصوديوم
840 مل DDH₂O
10 مل Triton-X100
(مثبطات البروتياز والفوسفات حسب الرغبة) 10X TAE (1 لتر) 48.4 جرام قاعدة تريس
11.42 مل حمض الخليك الجليدي
20 مل 0.5 م EDTA درجة الحموضة 8
ddH20 إلى 1 لتر 4X SDD-AGE المخزن المؤقت للتحميل (50 مل) 5 مل 10X TAE
10 مل جلسرين
4 مل 20٪ SDS
0.5 مل 10٪ بروموفينول أزرق
31 مل ddH₂O عازلة غسيل PBST (1 لتر) 100 مل 10xPBS
800 مل DDH₂O
1 مل توين20 10X PBS (10 لتر) 800 جرام كلوريد الصوديوم
20 جم KCl
144 جم Na₂HPO₄ · 2 ساعة₂O
24 جم KH₂PO₄
أضف ddH₂O إلى 10 لتر