Multimer-PAGE لفصل مجمعات البروتين الأصلية: تقنية فصل هجينة تتكون من Blue Native-PAGE و SDS-PAGE لفصل البروتينات متعددة المستويات السليمة عن محللة الأنسجة

الملخص

المصدر: Rhinesmith، T. et al.، Multimer-PAGE: طريقة لالتقاط وحل مجمعات البروتين في العينات البيولوجية. J. Vis. Exp. (2017).

يصف هذا الفيديو صفحة متعددة الطبقات لفصل مجمعات البروتين الأصلية عن متجانسات الأنسجة. هذه التقنية عبارة عن مزيج من تقنيات PAGE الأصلية الزرقاء و SDS-PAGE. يمكن وصف المجمعات المنفصلة ودراستها لدورها في عمل الخلية.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title">1. تحضير الأنسجة

1. قم بإعداد 10 مل من 4x BN-PAGE عينة عازلة (200 ملي مخلل (2-هيدروكسي إيثيل) أمينو تريس (هيدروكسي ميثيل) ميثان (Bis-Tris) ، 200 ملي كلوريد الصوديوم ، 40٪ وزن / حجم جلسرين ، 0.004٪ بونسو S ، درجة الحموضة 7.2) .
   ملاحظه: يمكن صنع محلول المخزون هذا مسبقا وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
2. تمييع 250 ميكرولتر من 4x عينة عازلة في 750 ميكرولتر dH₂O تحتوي على 1x كوكتيل مثبط البروتياز التجاري. دوامة وبرد على الجليد.
3. قم بتجانس 20 مجم من الأنسجة المستهدفة في 1 مل 1x المخزن المؤقت لعينة BN-PAGE البارد مع 30 ضربة من الخالط النظيف.
   ملاحظه: بالنسبة لهذه الت....

النتائج

p class = "jove_content" >
الشكل 1: مخطط انسيابي عام متعدد PAGE.< / > (أ) تحضير محللة الأنسجة باستخدام طرق غير تمسخ ، مثل التجانس في المخزن المؤقت لعينة BN-PAGE. (ب) تحلل الماصة في هلام BN-PAGE، ثم تقوم بإجراء الرحلان الكهربائي (150 فولت) في المخزن المؤقت لتشغيل BN-PAGE. اسمح للعينة بالترحيل حتى تهاجر مقدمة الصبغة ~ 2 سم إلى جل الحل. (ج) قم بإزالة طبقة التكديس والجزء غير المستخدم من طبقة الحل. (.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات المواد الكيميائيه حمض ε-أمينوكابرويك سيغما أ 2504 أكريلاميد أكروس أورجانكس 164855000 سام. أكريلاميد / بيساكريلاميد 37.5: 1 (محلول مخزون 40٪ طن) بيورراد 161-0148 سام. بيرسلفات الأمونيوم سيغما أ 3678 مضاد للأرانب IgG-HRP من الماعز سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية ال SC-2004 طقم فحص حمض البيسنكونينيك ثيرموفيشر هاتف: 23225 بيس تريس سيغما ب 9754 ألبومين مصل الأبقار سيغما أ 9647 بوتانول فيشر ساينتيك أ 399-1 طقم الركيزة التلألؤ الكيميائي ثيرموفيشر هاتف: 24078 كوماسي بلو G-250 سيجما ألدريتش ب 0770 ديجيتونين سيغما د141 سام. ثنائي ميثيل سلفوكسيد فيشر ساينتيك د128-1 ديثيوبيس (سوكسينيميديل بروبيونات) الترمو: العلمية هاتف: 22585 الحليب الجاف الخالي من الدسم مختبر علمي M0841 الجلسرين سيغما جي 9012 جلايسين فيشر ساينتيك ص381-5 كوكتيل وقف مثبطات البروتياز ثيرموفيشر 78430 حمض الهيدروكلوريك فيشر ساينتيك أ 144SI-212 للمعايرة بالتحليل الحجمي. الكاويه. ميثانول فيشر ساينتيك أ 412-4 لتنشيط غشاء PVDF. سام. أحادي النسيلة المضاد α سينوكلين IgG من الأرنب سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية SC-7011-R N ، N ، N '، N '- رباعي ميثيل إيثيلين ديامين سيغما تي 9281 N ، N'-methylenebisacrylamide أكروس أورجانكس 16479 [إ] سام. NP40 بوسطن بيوبروكتس ف -872 بولي سوربات 20 (توين -20) فيشر ساينتيك بي ت 337-500 أغشية نقل فلوريد البولي فينيلدين الترمو: العلمية 88518 بونسو إس سيغما ص 3504 كلوريد البوتاسيوم فيشر ساينتيك ص 217-3 فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة سيغما ص 9791 كوكتيل مثبط البروتياز الترمو: العلمية 88265 حل SDS (10٪ وزن حجم) بيورراد 161-0416 كلوريد الصوديوم فيشر ساينتيك ص358-212 كبريتات دوديسيل الصوديوم سيغما L37771 فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة فيشر ساينتيك BP329-1 تريسين سيغما تي 0377 قاعدة تريس فيشر ساينتيك بي ت 152-500 Tris-HCl (عازلة 0.5 م ، درجة الحموضة 6.8) بيورراد 161-0799 Tris-HCl (عازلة 1.5 م ، درجة الحموضة 8.8) بيورراد 161-0798 الصكوك جنرال إلكتريك إيمجكوانت LAS 4000 جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 28-9558-10 برنامج ImageJ المعاهد الوطنية للصحة قارئ الألواح الدقيقة Synergy H1 بيوتك جل سابق + حامل بيوراد جهاز طرد مركزي Microfuge 22R بيكمان كولتر 2 مل الخالط خلاط دوامة فيشر ساينتيك الخالط الأنسجة بالموجات فوق الصوتية فيشر ساينتيك FB120220