$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< ص الفئة = "jove_title">
1. تحضير الأنسجة
- قم بإعداد 10 مل من 4x BN-PAGE عينة عازلة (200 ملي مخلل (2-هيدروكسي إيثيل) أمينو تريس (هيدروكسي ميثيل) ميثان (Bis-Tris) ، 200 ملي كلوريد الصوديوم ، 40٪ وزن / حجم جلسرين ، 0.004٪ بونسو S ، درجة الحموضة 7.2) .
ملاحظه: يمكن صنع محلول المخزون هذا مسبقا وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- تمييع 250 ميكرولتر من 4x عينة عازلة في 750 ميكرولتر dH2O تحتوي على 1x كوكتيل مثبط البروتياز التجاري. دوامة وبرد على الجليد.
- قم بتجانس 20 مجم من الأنسجة المستهدفة في 1 مل 1x المخزن المؤقت لعينة BN-PAGE البارد مع 30 ضربة من الخالط النظيف.
ملاحظه: بالنسبة لهذه التجربة التوضيحية ، فإن الأنسجة المستهدفة هي أنسجة دماغ الفئران الكاملة. بعد التجانس ، يمكن معالجة العينات بمنظف معتدل مثل 2٪ ديجيتونين للذوبان والسماح بالرحلان الكهربائي لبروتينات الغشاء.
- انقل الجانس إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، وجهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم لمدة 30 دقيقة إلى محتويات خلوية غير قابلة للذوبان من الحبيبات. بعد الطرد المركزي ، صب المادة الطافية في أنبوب نظيف على الجليد.
- اتبع تعليمات الشركة المصنعة لقياس تركيز البروتين الطافي باستخدام حمض البيسنكونينيك (BCA) أو مقايسة كمية البروتين المماثلة.
- إذا كانت العينة (العينات) المتجانسة تحتوي على منظف ، أضف كمية 5٪ Coomassie Blue G-250 في محلول مائي يكفي لجلب المحلول المتجانس إلى 0.25٪ Coomassie.
< p class = "jove_title" >
2. BN-PAGE
- قم بتخفيف 25 مل 20x مخزون الرحلان الكهربائي الأزرق الأصلي (BN) (1.0 M Bis-Tris ، 1.0 M tricine ، درجة الحموضة 6.8) إلى 475 مل dHH2O يحتوي على 0.002٪ Coomassie Blue لصنع 500 مل من 1x تشغيل المخزن المؤقت.
- إذا كانت العينات تحتوي على منظف ، فقم بدلا من ذلك بعمل 250 مل من 1x Running Buffer يحتوي على 0.02٪ Coomassie و 250 مل أخرى تحتوي على لا شيء.
- يبرد المخزن المؤقت (المؤقتات) إلى 4 درجات مئوية.
- قم بتنظيف وتجميع كاسيت صب هلام بولي أكريلاميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- صب جل بولي أكريلاميد BN (طبقة تكديس 3٪ T ، طبقة حل 6٪ T) وفقا للوصفة القياسية وضع مشط البئر.
- بعد بلمرة المواد الهلامية ، اشطف الكاسيت ب dH2O وقم بتجميع جهاز الرحلان الكهربائي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- قم بإزالة مشط البئر واملأ الآبار بمخزن مؤقت تشغيل 1x BN-PAGE. تجنب ملء الغرفة الداخلية بأكملها بالمخزن المؤقت حتى يتم تحميل العينات.
- إذا كانت العينات تحتوي على منظف ، فاملأ الآبار بالمخزن المؤقت الذي يحتوي على 0.02٪ Coomassie Blue.
ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات 2.7-2.9 عند 4 درجات مئوية.
- باستخدام أطراف تحميل الهلام، قم بإدخال حجم من الجانسات يحتوي على 20 ميكروغرام من البروتين في الآبار المرغوبة. ماصة حجم مكافئ من 1x BN-PAGE عينة مؤقتة في أي آبار غير مستخدمة.
ملاحظه: استخدم تركيز البروتين المحدد من اختبار BCA لحساب الحجم المناسب للتجانس لإضافته إلى الآبار.
- بعد تحميل العينات ، املأ الغرفة الداخلية بمخزن مؤقت للتشغيل 1x BN-PAGE. تأكد من أن الجل مغمور بالكامل في المخزن المؤقت. بعد ذلك ، املأ الغرفة الخارجية بمخزن مؤقت تشغيل 1x إلى المستوى الذي حددته الشركة المصنعة.
- إذا كانت العينات تحتوي على منظف ، فاملأ الغرفة الداخلية بمخزن 1x يحتوي على 0.02٪ Coomassie Blue ، والغرفة الخارجية بمخزن مؤقت 1x خال من الصبغة.
- قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمصدر الطاقة وقم بعمل البروتينات الموجودة في الجل عند 150 فولت حتى يتقدم نطاق الصبغة ~ 2 سم إلى طبقة الحل. أوقف مصدر الطاقة وافصله.
3. الربط المتبادل
ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات 3.1-3.6 عند 4 درجات مئوية.
- قم بتفكيك جهاز الرحلان الكهربائي وافصل الألواح الزجاجية لكاسيت الجل. قم بإزالة طبقة التراص وتجاهلها.
- قم بقص الجل بعناية أسفل الحافة السفلية لواجهة الصبغة. احرص على جعل هذا القطع سلسا ومستقيما قدر الإمكان ، ثم تخلص من قطعة الجل غير المستخدمة. سيترك هذا شريطا أفقيا بعرض ~ 2 سم من هلام بولي أكريلاميد ، والذي سيحتوي على كل البروتين في العينة المتجانسة.
- قم بقص أي أجزاء غير مستخدمة على طول حواف شريط الجل.
- ضع الشريط بحذر في محلول ملحي مخزن بالفوسفات سعة 10 مل (PBS) في وعاء صغير ، واخلطه برفق عن طريق التعويذة لمدة 30 دقيقة حتى يتوازن.
- بعد التوازن ، تخلص من PBS واستبدله ب 10 مل أخرى. ماصة 500 ميكرولتر من 25 ملي مولار DSP مذابة في ثنائي ميثيل سلفوكسيد في PBS ، واستمر في الخلط على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 3.4) لمدة 30 دقيقة.
- اسكب محلول DSP. أضف 10 مل من 0.375 M tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) ، الرقم الهيدروجيني 8.8 ، الذي يحتوي على 2٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) لإخماد DSP غير المتفاعل. استمر في التعويذة لمدة 15 دقيقة.
4. SDS-PAGE
أثناء تبريد - شريط الجل ، قم بإعداد محاليل جل SDS-PAGE وفقا للطرق القياسية. لا تضيف كواشف البلمرة.
- بعد التبريد ، أعد شريط الجل ΒΝ إلى درجة حرارة الغرفة ، وقم بصب الشريط في كاسيت هلام جديد.
- للقيام بذلك ، التقط الجل بعناية وضعه على لوحة فاصل كاسيت هلام نظيفة.
- قم بتوجيه الشريط بحيث يكون الجزء السفلي من واجهة الصبغة أقرب إلى الجزء العلوي من الكاسيت الجديد (على سبيل المثال ، يجب أن يكون الجانب الذي سافر إلى أبعد أثناء BN-PAGE هو الأقرب إلى الجزء العلوي من الكاسيت الجديد ؛ يجب قلب شريط الجل من اتجاهه السابق). انظر الشكل 1.
- ضع الشريط بحيث تكون حافته العلوية حتى مع مكان الحافة العلوية للوحة الغطاء (أي سيكون في الجزء العلوي من الجل الجديد). تأكد من أن واجهة الصبغة موازية للحواف الأفقية للوحة الزجاجية.
- ادفع جانبا واحدا من الشريط المقطوع على أحد جدران الفاصل ، مع ترك مساحة على الجانب الآخر لسكب الجل وتحميل معيار البروتين أو السلم.
- إذا كانت الحافة السفلية لشريط الجل تحتوي على أي مناطق خشنة أو غير مستوية ، فقم بقصها بعناية. إذا كانت موجودة ، فسوف تحبس الفقاعات أثناء صب الجل.
- بمجرد وضع شريط الجل بشكل صحيح ، ضع لوحة الغطاء فوق لوحة الفاصل. استخدم ضغطا برفق لدفع أي فقاعات هواء محاصرة.
- استمر في تجميع جهاز صب الهلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- أضف كواشف البلمرة إلى المخزن المؤقت للهلام المحلل ، واسكبه في كاسيت الجل المحضر ، باستخدام ماصة مصلية. املأ علبة الجل إلى ~ 2 سم أسفل شريط جل BN-PAGE المقطوع ، لترك مساحة لطبقة التكديس.
- أضف 100 ميكرولتر من البيوتانول فوق الجزء العلوي من الجل المصبوب واترك 30 دقيقة لبلمرة طبقة الحل. اسكب البيوتانول.
- أضف كواشف البلمرة إلى محلول هلام التكديس. باستخدام ماصة مصلية ، اسكب طبقة التكديس لملء كل المساحة الفارغة المتبقية في علبة الجل.
- قم بإمالة كاسيت الجل أثناء سكب طبقة التكديس بحيث تملأ الفراغ أسفل شريط الجل ، ولا يتم احتجاز فقاعات الهواء.
- نظرا لأن المخزن المؤقت لجل التكديس يملأ المساحة الفارغة أسفل شريط الجل ، أعد علبة الجل تدريجيا إلى مستوى القدم.
- استمر في ملء المساحة الفارغة بجوار شريط الجل المستأصل بمحلول جل التكديس ، حتى يفيض تقريبا.
- اسمح لطبقة التكديس بالبلمرة لمدة 30 دقيقة
ملاحظه: اصنع 10x SDS-PAGE عازل قيد التشغيل (250 ملي مولار تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان (تريس) ، 1.9 م جلايسين ، 1٪ SDS) أثناء بلمرة الجل. يمكن أيضا إجراء ذلك مسبقا وتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
- قم بتخفيف 50 مل 10x SDS-PAGE من مخزون المخزن المؤقت في 450 مل dH2O لإنشاء مخزن مؤقت يعمل 1x.
- بعد بلمرة طبقة التكديس ، قم بإزالة كاسيت الجل من جهاز الصب ، واشطفه ب dH2O ، وقم بتجميع جهاز الرحلان الكهربائي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- املأ الغرفة الداخلية بالكامل بمخزن مؤقت للتشغيل 1x SDS-PAGE ، ثم املأ الغرفة الخارجية إلى المستوى الذي حددته الشركة المصنعة.
- قم بتحميل المساحة المجاورة لشريط الجل المستأصل بسلم الوزن الجزيئي أو معيار البروتين المناسب.
- قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمصدر الطاقة ، وقم بتشغيل العينات بالكهرباء عند 120 فولت. عندما تنفد صبغة Coomassie من الجل ، أوقف مصدر الطاقة وافصله.
- تحليل الجل باستخدام الطرق القياسية للنشاف الكهربائي والكشف عن البروتين عن طريق ربط الأجسام المضادة.
