الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز لأمبليكونات الحمض النووي بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): طريقة لتحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال وتقييم نجاح تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل

الملخص

المصدر: Gulla ، S. et al. تحليل تكرار ترادفي متعدد الموضع لبكتيريا اليرسينيا روكري المسببة للأمراض السمكية بواسطة Multiplex PCR والرحلان الكهربائي الشعري. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نوضح فصل الحمض النووي البكتيري المضخم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. يعمل هلام الاغاروز كمنخل جزيئي ، مما يمكن الحمض النووي سالب الشحنة من الهجرة بناء على حجمه تحت مجال كهربائي مطبق.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تأكيد أمبليكون تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي

1. وفقا لتوصيات الشركة المصنعة ، قم بإعداد حجم 1.5٪ (وزن / حجم) جل الاغاروز في 1x tris-borate-EDTA (TBE) عازلة مناسبة لعدد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل المراد اختبارها. قبل الصب ، أضف 5 ميكرولتر من صبغة الحمض النووي الفلوري لكل 50 ميكرولتر من محلول الهلام واخلطها. استخدم الصواني والأمشاط حسب الاقتضاء للصب ، مع ترك عدد مناسب من الآبار خالية للسلالم المرجعية للحمض النووي.
2. بعد الضبط ، اغمر الجل في 1x TBE-buffer في نظام GE. امزج 5 ميكرولتر من منتج PCR مع 2 ميكرولتر من صبغة التحميل وانقلها إلى آبار الهلام. أضف 5 ميكرولتر من سلم الحمض النووي في الآبار الفارغة كمرجع.
3. قم بتشغيل الجل عند 110 فولت لكل 15 سم لمدة ساعة واحدة تقريبا واستخدم نظام تصوير / تصور هلام قائم على الأشعة فوق البنفسجية للتحقق من وجود نطاقات متعددة (حتى خمسة) تمثل أمبليكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل (انظر المثال في الشكل 1). تخلص من الجل. قم بتخزين منتجات PCR المتبقية في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة.

النتائج

p class = "jove_content" >
الشكل 1: الرحلان الكهربائي للهلام يتحقق من وجود العديد من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تؤكد الصورة وجود العديد من أمبليكونات PCR في جميع الممرات ال 12 التي تحتوي على عينات ، حيث يمثل الممر الأول سلم الحمض النووي المستخدم. تمت الإشارة إلى أحجام شظايا السلم المختارة ، وكذلك مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل والانتماء إلى الإجهاد لكل حارة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أغاروز، عالمي، peqGOLD VWR 732-2789P / 732-2788 المخزن المؤقت Tris-borate-EDTA (TBE) غير أ غير أ الوصفة القياسية ؛ أنتجت في المنزل. صبغة تحميل هلام الحمض النووي (6X) ثيرمو فيشر العلمي R0611 نظام الرحلان الكهربائي للهلام حسب التفضيل غير أ جل صبغة الحمض النووي الأحمر ، 10,000X في الماء البيوتيوم 41003 صبغة الحمض النووي الفلوري سلم الحمض النووي GeneRuler 50 نقطة أساس ، جاهز للاستخدام ثيرمو فيشر العلمي SM0373 سلم الحمض النووي نظام تصوير / تصور هلام قائم على الأشعة فوق البنفسجية حسب التفضيل غير أ