الرحلان الكهربائي الشعري: تقنية لتحليل أمبليكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل المسمى بالفلورسنت

الملخص

المصدر: Gulla، S. et al.، تحليل تكرار ترادفي متغير العدد متعدد المواقع لبكتيريا اليرسينيا روكري المسببة للأمراض للأسماك بواسطة Multiplex PCR والرحلان الكهربائي الشعري. J. Vis. Exp. (2019)

يصف هذا الفيديو تقنية الرحلان الكهربائي الشعري لتحليل أمبليكون تفاعل البوليميراز المتسلسل المسمى بالفلورسنت الذي تم الحصول عليه من عينات مختلفة بناء على حجمها. يولد نمطا مهاجرا يحدد أطوال أزواج القاعدة للشظايا بمساعدة صبغة الفلورسنت المسماة في كل جزء.

البروتوكول

1. إعداد الرحلان الكهربائي الشعري وشروط التشغيل

1. بعد تأكيد مكبرات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بتخفيف منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل 1:10 (حجم / حجم) في الماء النقي. ختم وخلط وجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة.
2. العمل في خزانة الدخان ، قم بإعداد حجم من المزيج الرئيسي يتكون من 9 ميكرولتر من الفورماميد و 0.5 ميكرولتر من الحجم القياسي لكل منتج PCR (السماح بحجم فائض بنسبة 10٪). دوامة لفترة وجيزة وتوزيع 9.5 ميكرولتر في آبار على لوحة مناسبة لنظام CE المتاح قبل إضافة 0.5 ميكرولتر من منتج PCR المخفف. ختم وخلط وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة.
   تنبيه: تعامل معها بعناية. خلط الفورماميد بالماء يولد حمض الفورميك ، وهو سام.
3. باستخدام جهاز التدوير الحراري PCR ، قم بتغيير طبيعة العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق قبل التبريد إلى 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة وقم بتحميل اللوحة على نظام CE معاير وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
4. قم بتشغيل تحليل الشظايا CE باستخدام الكواشف حسب الملاءمة للجهاز الذي تختاره والإعدادات التالية: 60 درجة مئوية ؛ حقن 5 ثوان عند 1.6 كيلو فولت (32 فولت لكل سم) ؛ 32 دقيقة من وقت التشغيل عند 15 كيلو فولت (300 فولت لكل سم). عادة ما يستغرق تحليل شظايا CE ل 24 بئرا على 24 شعريا (50 سم) حوالي 50 دقيقة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أفانت 3500xL محلل وراثي ثيرمو فيشر العلمي أ30469 تستخدم لتحليل شظايا الرحلان الكهربائي الشعري. جل صبغة الحمض النووي الأحمر ، 10,000X في الماء البيوتيوم 41003 صبغة الحمض النووي الفلورية المستخدمة أثناء الرحلان الكهربائي للهلام. برنامج GeneMapper 5 ثيرمو فيشر العلمي 4475073 تستخدم لقراءة الرسوم البيانية الكهربية من الرحلان الكهربائي الشعري. GeneScan 600 LIZ صبغة الحجم القياسي v2.0 ثيرمو فيشر العلمي 4408399 معيار الحجم المستخدم أثناء الرحلان الكهربائي الشعري. هاي دي فورماميد ثيرمو فيشر العلمي 4311320/4440753 يستخدم الفورماميد منزوع الأيونات أثناء الرحلان الكهربائي الشعري. تحضير المشروبات الكحولية العاملة. ماء Milli-Q غير أ غير أ المياه النقية المستخدمة أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي الشعري. وصفة قياسية أنتجت داخليا. POP-7 بوليمر للمحللات الجينية 3500 Dx / 3500xL Dx ثيرمو فيشر العلمي أ 26077 / 4393713 / 4393709 مصفوفة الفصل المستخدمة أثناء الرحلان الكهربائي الشعري. نظام تصوير / تصور هلام قائم على الأشعة فوق البنفسجية حسب الرغبة. غير أ دوامة حسب الرغبة. غير أ