الرحلان الكهربائي للهلام القلوي أحادي الخلية: تقنية حساسة للتقدير الكمي لتلف الحمض النووي في الخلايا السرطانية الفردية بعد العلاج الكيميائي

الملخص

المصدر: Lu ، Y. ، et al. تقييم تلف الحمض النووي في المختبر باستخدام مقايسة المذنب J. Vis. Exp. (2017)

في هذا الفيديو ، نوضح مقايسة الرحلان الكهربائي القلوية أحادية الخلية لتحديد فواصل الحمض النووي أحادية ومزدوجة الخيط في الخلايا المعالجة بالدوكسوروبيسين. تؤدي الظروف القلوية إلى تعطيل الروابط الهيدروجينية بين أزواج قواعد الحمض النووي ، مما يؤدي إلى الفك الكامل وفصل خيوط الحمض النووي. يسمح ذلك بالهجرة التفاضلية لشظايا الحمض النووي غير التالفة والتالفة في هلام الاغاروز عند الرحلان الكهربائي ، مما يكشف عن بنية على شكل مذنب من الحمض النووي غير التالف المهاجر ببطء الذي يشكل رأس المذنب الدائري ، وترحيل شظايا الحمض النووي التالفة بسرعة التي تشكل ذيل المذنب الممدود.

البروتوكول

1. تحضير الكواشف

1. 1x برنامج تلفزيوني
   1. قم بتخفيف 100 مل 10x PBS مع 900 مل dH₂O واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
2. محلول التحلل (LS)
   1. تحضير 2.5 م كلوريد الصوديوم ، و 100 ملي مولار ثنائي الصوديوم EDTA ، و 10 ملي مولار قاعدة تريس ، و 200 ملي مولار هيدروكسيد الصوديوم في 900 مل ديسيموتر₂O ؛ عادة ما يستغرق الأمر حوالي 20 دقيقة للسماح للخليط بالذوبان تماما. اضبط الرقم الهيدروجيني على 10 باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. أضف 1٪ ساركوسينات لوريل الصوديوم و 1٪ تريتون X-100 واضبط الحجم النهائي على 1,000 مل. تبرد إلى 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
3. محلول الرحلان الكهربائي القلوي (AES) ، الرقم الهيدروجيني >13
   1. قم بإعداد 200 ملي مولار هيدروكسيد الصوديوم و 1 ملي مولار ثنائي الصوديوم EDTA في 800 مل ديسيموكراتيون₂O. اضبط الرقم الهيدروجيني وتأكد من أنه الرقم الهيدروجيني >13. اضبط مستوى الصوت النهائي على 1,000 مل. يصنع طازجا قبل الاستخدام ويبرد إلى 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام
4. محلول تلطيخ
   1. 1. أضف 1 ميكرولتر 10،000x صبغة الحمض النووي الفلوري الأخضر (على سبيل المثال ، SYBR Green) في 30 مل من المخزن المؤقت Tris-EDTA (10 ملي Tris-HCl ، 1 ملي مولار ثنائي الصوديوم EDTA ، الرقم الهيدروجيني 7.4) وتخزينه في 4 درجات مئوية. حماية من الضوء.
5. 1٪ انخفاض ذوبان الاغاروز
   1. قم بإذابة 1٪ من الاغاروز ذات نقطة الانصهار المنخفضة (1 جم في 100 مل ، ديسيون_{، 2}درجة مئوية) في الميكروويف. قم بتدوير الاغاروز كل 15-20 ثانية للتأكد من أن الاغاروز منصهر تماما. ضع الاغاروز في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
6. أطراف ماصة مسبقة التسخين
   1. اقطع الأطراف الضيقة لأطراف الماصة P200 بمقدار 3 مم ودفئها عند 37 درجة مئوية قبل سحب الماصة.

< p class = "jove_title" style = "margin-left: 14.2pt ؛ ">2. إعداد شرائح المذنب

1. طلاء الشريحة
   1. قم بإذابة 1٪ من الاغاروز (1 جم في 100 مل ، ديسيون_{هرتز 2}O) في الميكروويف لمدة 2-3 دقائق أو حتى يذوب الاغاروز تماما. اغمس شرائح المجهر الزجاجي في الاغاروز وامسح جانبا واحدا من الشريحة باستخدام منديل خال من النسالة.
   2. ضع الشرائح على سطح مستو لتجف في الهواء أو تسخينها عند 50 درجة مئوية لتجفيف أسرع ؛ يجب تشكيل فيلم الاغاروز الشفاف بعد التجفيف. ضع الشرائح المطلية في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
2. تحضير معلقات الخلية المفردة
   1. زراعة وعلاج خلية الورم الدبقي
      1. استزراع خلايا U251 MG في وسط DMEM-Ham F-12 المكمل بنسبة 10٪ FBS و 100 U / مل بنسلين و 10 ميكروغرام / مل ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
      2. هضم الخلايا باستخدام 1 مل من التربسين لمدة 3 دقائق وتحييد التربسين باستخدام وسيط DMEM-Ham F-12 مع FBS. اجمع في أنبوب سعة 15 مل ، وقم بالدوران عند 300 × جم لمدة 4 دقائق ، واستنشق الوسط ، الخلايا عند 2 × 10⁵ خلية / مل في 1x PBS.
         ملاحظه: يجب تحضير عينة الخلية مباشرة قبل بدء الفحص ويجب التعامل مع جميع العينات في بيئة مظلمة أو باهتة لمنع تلف الحمض النووي من الضوء.
      3. امزج معلق الخلية مع 1٪ من نقطة الانصهار المنخفضة المنصهرة (عند 37 درجة مئوية) بنسبة 1:10 (حجم حجمي / حجم) ، واخلطه برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ، ثم قم على الفور بوضع 30 ميكرولتر على شريحة مطلية بالأغروز. استخدم جانب طرف الماصة لنشر خليط الاغاروز / الخلية لضمان تكوين طبقة رقيقة.
      4. ضع الشريحة بشكل مسطح عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 10 دقائق. تؤدي زيادة وقت التبلور إلى 30 دقيقة إلى تحسين التصاق العينات في بيئات الرطوبة العالية.
      5. اغمر الشريحة في 4 درجات مئوية LS في الظلام لمدة ساعة إلى ليلة واحدة.
3. الرحلان الكهربائي أحادي الخلية
   1. لفحص المذنب القلوي
      1. قم بإزالة الشرائح برفق من LS ، واستنزاف المخزن المؤقت الزائد ، واغمرها برفق في AES لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية للسماح بفك الحمض النووي. احتفظ بالشرائح في الظلام.
      2. أضف AES المبرد مسبقا في صينية شرائح الرحلان الكهربائي ، ولا تتجاوز 0.5 سم فوق الشرائح (هذا يعتمد على حجم وحدات الرحلان الكهربائي) ، ضع الشرائح بالداخل وقم بتغطيتها بغطاء. اضبط جهد مصدر الطاقة على 1 فولت / سم (الطول بين الأقطاب الكهربائية) وقم بتشغيله لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      3. استنزاف محلول الرحلان الكهربائي الزائد من الشريحة. اغمر الشرائح برفق مرتين في dH₂O لمدة 5 دقائق لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
      4. اغمر الشرائح برفق في 70٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انتقل إلى تلطيخ.
شرائح
4. المذنب وصمة عار
   1. تجف الشرائح عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة في الظلام.
   2. ضع 50-100 ميكرولتر من محلول تلطيخ الحمض النووي الفلوري الأخضر على كل من أحجار الاغاروز المجففة وصمة عار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
   3. اشطف الشرائح لفترة وجيزة في درجة حرارة₂درجة مئوية وجففها تماما عند 37 درجة مئوية في الظلام. انتقل إلى الحصول على الصور وتحليلها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 10x PBS (Ca ⁺⁺ ، Mg ⁺⁺ مجانا) تكنوفا P0196 كلوريد الصوديوم سيغما S5886 EDTA تكنوفا E0308 قاعدة Trizma سيغما [ت1503] هيدروكسيد الصوديوميوم سيغما 72068 ساركوسينات لوريل الصوديوم سيغما L7414 تريتون X-100 سيغما 93443 SYBR الأخضر إنفيتروجين S33102 انخفاض نقطة الانصهار الاغاروز إنفيتروجين 16520 [إ] أغاروز إنفيتروجين 16500 95٪ إيثانول وارنر جراهام # 64-17-5 التربسين جيبكو هاتف: 25300-054 شرائح المناديل الزجاجية علوم المجهر الإلكتروني 63422-11 كيمويبس كيمبرلي كلارك 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة دينفيل أطراف الماصة حاد المايكرويف افانتي حمام مائي دقة غرفة الرحلان الكهربائي الأفقي تريفيجن كوميتاساي ES II مزود الطاقة بيو راد حاضنه مختبر كوينسي نموذج 12-140E مجهر الفلورسنت زييس إل إس إم 700 ماصة دقيقة إيبندورف