الرحلان الكهربائي الشعري للموائع الدقيقة لتحجيم شظايا منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): تقنية فصل كهربائي قائمة على الرقائق الدقيقة لفصل شظايا الحمض النووي بناء على الحجم

الملخص

المصدر: Wang ، H. ، Zhu et al. اختبار قوي قائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل لقياس تكرار ثلاثي النوكليوتيدات السيتوزين والجوانين والجوانين في جين التخلف العقلي X الهش -1. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو تقنية الرحلان الكهربائي الشعري الموائع الدقيقة لفصل أمبليكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل بناء على حجمها. تساعد هذه التقنية في تحجيم الأجزاء باستخدام الأصباغ الفلورية وعلامات الحجم الجزيئي القياسية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحجيم جزء منتجات PCR

1. قبل البدء ، اسمح لتركيز صبغة الحمض النووي ، ومصفوفة هلام الحمض النووي ، وعلامة الحمض النووي ، وسلم الحمض النووي ، وعينات الحمض النووي المنقاة بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
2. إعداد محطة التحضير
   1. استبدل المحقنة (انظر جدول المواد) عند استخدام دفعة جديدة من الكواشف.
   2. اضبط لوحة القاعدة ، وحرر ذراع مشبك الحقنة وحركها لأعلى إلى الموضع العلوي.
3. ابدأ برنامج التحجيم (انظر جدول المواد) وقم بإعداد مزيج صبغة الجل.
4. تركيز صبغة دوامة لمدة 10 ثوان وتدور لأسفل. أضف 25 ميكرولتر من الصبغة إلى قارورة مصفوفة هلامية. دوامة المحلول المختلط جيدا وتدور لأسفل.
   1. انقل مزيج صبغة الجل إلى مرشح الدوران. ضع مرشح الدوران في جهاز طرد مركزي دقيق وقم بالدوران لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة عند 1,500 × جم ± 20٪.
      ملاحظة: قم بحماية المحلول بالصبغة من الضوء وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية بعد الاستخدام. يمكن استخدام مزيج صبغة الجل لحوالي 15 شريحة بمجرد تحضيرها. اترك مزيج صبغة الجل يتوازن مع درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في كل مرة قبل الاستخدام.
5. قم بتحميل مزيج صبغة الجل
   1. أدخل شريحة DNA جديدة في محطة التحضير. أضف 9 ميكرولتر من مزيج صبغة الهلام إلى السمة الجيدة بعلامة "G". يرجى التأكد من وضع المكبس عند علامة 1 مل ثم إغلاق محطة التحضير.
   2. اضغط على مكبس المحقنة لأسفل حتى يتم تثبيته بواسطة المشبك. انتظر لمدة 30 ثانية بالضبط ثم حرر المقطع. انتظر لمدة 5 ثوان ، ثم اسحب المكبس ببطء إلى وضع 1 مل.
   3. افتح محطة التحضير وأضف 9 ميكرولتر من مزيج صبغة الهلام في الآبار المميزة بعلامة "G".
6. أضف 5 ميكرولتر من العلامة إلى البئر المميز برمز السلم وأضف أيضا 5 ميكرولتر من العلامة في كل من بئر العينة البالغ عددها 12 بئر. لا تترك أي آبار فارغة.
7. أضف 1 ميكرولتر من سلم الحمض النووي إلى البئر المميز برمز السلم. أضف 1 ميكرولتر من منتج PCR (الآبار المستخدمة) أو 1 ميكرولتر من الماء فائق النقاء (الآبار غير المستخدمة) في كل بئر من عينات الآبار البالغ عددها 12 بئر. ضع الشريحة أفقيا في محول خلاط الدوامة والدوامة لمدة 1 دقيقة في الإعداد المشار إليه (2,400 دورة في الدقيقة).
8. أدخل الشريحة في أداة المحلل الحيوي وقم بتشغيل الشريحة في الجهاز في غضون 5 دقائق.
9. بعد اكتمال الفحص ، قم بإزالة الشريحة المستخدمة على الفور من الأداة.
10. أضف ببطء 350 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات في أحد آبار منظف القطب. افتح غطاء المحلل الحيوي وضع منظف القطب الكهربائي فيه. أغلق الغطاء واحتضنه لمدة 10 ثوان. افتح الغطاء وقم بإزالة منظف القطب. انتظر 10 ثوان أخرى للسماح للماء الموجود على الأقطاب الكهربائية بالتبخر ثم أغلق الغطاء.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أداة المحلل الحيوي Agilent 2100: أنابيب PCR سعة 0.2 مل أكسايجن PCR-02D-C أداة المحلل الحيوي Agilent 2100: 1x عازلة TE ، درجة الحموضة 8.0 ، خالية من Rnase أمبيون AM9849 أداة المحلل الحيوي Agilent 2100: أداة المحلل الحيوي 2100 رشيق G2939AA أداة المحلل الحيوي Agilent 2100: لوحة PCR 96 بئر ثيرمو فيشر AB0800 أداة المحلل الحيوي Agilent 2100: خرطوشة القطب الكهربائي رشيق لوازم معدات أداة المحلل الحيوي 2100 أداة المحلل الحيوي Agilent 2100: خلاط دوامة IKA رشيق لوازم معدات أداة المحلل الحيوي 2100 أداة Agilent 2100 Bioanalyzer: برنامج التحجيم 2100 برنامج خبير رشيق لوازم معدات أداة المحلل الحيوي 2100 أداة المحلل الحيوي Agilent 2100: رقائق الاختبار رشيق لوازم معدات أداة المحلل الحيوي 2100 مجموعة Agilent DNA 7500 رشيق 5067-1506 لتحجيم الأجزاء مجموعة Agilent DNA 7500: سلم DNA 7500 (غطاء أصفر) رشيق في المجموعة: مجموعة Agilent DNA 7500 (رقم الكتالوج: 5067-1506) مجموعة Agilent DNA 7500: علامات DNA 7500 (غطاء أخضر) رشيق في المجموعة: مجموعة Agilent DNA 7500 (رقم الكتالوج: 5067-1506) مجموعة Agilent DNA 7500: رقائق الحمض النووي رشيق في المجموعة: مجموعة Agilent DNA 7500 (رقم الكتالوج: 5067-1506) مجموعة Agilent DNA 7500: مركز صبغة الحمض النووي (غطاء أزرق) رشيق في المجموعة: مجموعة Agilent DNA 7500 (رقم الكتالوج: 5067-1506) مجموعة Agilent DNA 7500: قارورة مصفوفة جل الحمض النووي (غطاء أحمر) رشيق في المجموعة: مجموعة Agilent DNA 7500 (رقم الكتالوج: 5067-1506) مجموعة Agilent DNA 7500: منظف القطب الكهربائي رشيق في المجموعة: مجموعة Agilent DNA 7500 (رقم الكتالوج: 5067-1506) مجموعة Agilent DNA 7500: مرشح الدوران رشيق مستلزمات مجموعة Agilent DNA 7500 (رقم الكتالوج: 5067-1506) مجموعة Agilent DNA 7500: حقنة رشيق مستلزمات مجموعة Agilent DNA 7500 (رقم الكتالوج: 5067-1506) محطة فتيلة رقاقة رشيق 5065-4401 لوازم معدات أداة المحلل الحيوي 2100 مشعب فراغ لوحة الترشيح: MultiScreenHTS فراغ المشعب ميرك ميليبور MSVMHTS00 أداة فراغ لمشعب فراغ لوحة الترشيح لتنقية منتج PCR مشعب فراغ لوحة الترشيح: سدادة سيليكون ميرك ميليبور XX2004718 مشعب فراغ لوحة الترشيح مشعب فراغ لوحة الترشيح: مضخة فراغ ميرك ميليبور WP6122050 مشعب فراغ لوحة الترشيح مشعب فراغ لوحة الترشيح: وعاء جمع النفايات ميرك ميليبور XX1004705 مشعب فراغ لوحة الترشيح