صفحة SDS غير المختزلة: طريقة لتحليل مجمعات البروتين متعدد الأشكال المرتبطة بثاني كبريتيد

الملخص

المصدر: Rotoli، S. M. et al.، الجمع بين تحليل SDS-PAGE غير المختزل والتشابك الكيميائي للكشف عن المجمعات متعددة الكبريتيد التي استقرت بواسطة روابط ثاني كبريتيد في خلايا الثدييات في الثقافة. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو تقنية فصل عينات البروتين عن طريق SDS-PAGE غير المختزل لتحليل مجمعات البروتين متعدد المجموعات. تحتفظ هذه التقنية بالوحدات الفرعية متعددة البروتين الذي تحتفظ به روابط ثاني كبريتيد والتي يمكن تحليلها لاحقا عن طريق النشاف الغربي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. منع بقايا السيستين الحرة باستخدام اليودوأسيتاميد

1. قم بزراعة خلايا U-2 OS في طبق 6 سم² إلى التقاء 50٪ -60٪ في الحد الأدنى من الوسط الأساسي مع نسبة عالية من الجلوكوز يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بيروفات الصوديوم عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. اصنع مخزونا جديدا من 10 ملي مولار من اليودوأسيتاميد قبل الاستخدام مباشرة ، ثم تخلص من أي كاشف غير مستخدم.
3. أضف 0.1 ملي مولار من التركيز النهائي يودوأسيتاميد مباشرة إلى وسط زراعة الخلية. هز الطبق برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.

< p class = "jove_title" >2. حصاد الخلايا

1. استنشق الوسائط من الخلايا.
2. اغسل الخلايا ب 5 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات البارد (PBS) ثلاث مرات. قم بشفط محلول غسيل PBS النهائي ثم أضف 1 مل من PBS البارد.
3. اكشط الخلايا من قاع الطبق باستخدام مكشطة الخلية. باستخدام ماصة سعة 1 مل، اسحب PBS وتعليق الخلية وقم بتوزيع كل السائل في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
4. قم بتدوير الخلايا عند 7,500 × جم لمدة ثلاث دقائق عند 4 درجات مئوية. يمكن تخزين حبيبات الخلية عند -80 درجة مئوية حتى المعالجة

< p class = "jove_title" >3. استخراج البروتين

1. قم بإعداد 100 ميكرولتر من محلول تحلل 1x مخفف في ddH₂O (انظر جدول المواد). أضف فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF) مباشرة قبل الاستخدام إلى تركيز نهائي يبلغ 1 ملليمول.
2. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل 1x مباشرة إلى حبيبات الخلية وقم بتعليقها. احتضن هذا على الجليد لمدة 5 دقائق.
3. صوتي لمدة 8 ثوان باستخدام وضع النبض الثابت بنسبة 40٪ (انظر جدول المواد للصوتي ؛ اضبط حسب الضرورة لأجهزة صوتي مختلفة) ، مع الحفاظ على المستخلص على الجليد.
4. قم بتدوير المستخلص عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق عند 16,000 × جم. المادة الطافية هي جزء البروتين القابل للذوبان. يمكن إجراء تحليل برادفورد لتحديد تركيز البروتين إذا رغبت في ذلك.

< p class = "jove_title" >4. تحضير العينة

1. خذ 10 ميكرولتر من مستخلص البروتين القابل للذوبان وأضف 10 ميكرولتر من 1x Laemmli SDS-عينة (4٪ SDS ، 20٪ جلسرين ، 0.004٪ بروموفينول أزرق ، و 0.125 M Tris-HCl ، درجة الحموضة 6.8). لا تضيف أي كواشف مختزلة.
2. احتفظ بالعينات على الجليد إذا كان سيتم إجراء تحليل SDS PAGE في ذلك اليوم ؛ للتخزين طويل الأجل ، -20 درجة مئوية مناسبة. قبل تشغيل الجل مباشرة ، سخني العينة لمدة 5 دقائق عند 85 درجة مئوية.

فئة < ص = "jove_title" >5. في الجسم الحي الفورمالديهايد الربط المتبادل للبروتينات الذاتية في خلايا U-2 OS

1. قم بزراعة خلايا U-2 OS في قارورة 175 سم² إلى 70٪ -80٪ التقاء.
2. قم بإجراء تفاعل التشابك الفورمالديهايد
   1. في غطاء الدخان ، تناول محلول فورمالديهايد بنسبة 37٪ تم شراؤه من مصادر تجارية. أضف مثبت الفورمالديهايد مباشرة إلى الوسط إلى التركيز النهائي بنسبة 1٪ واحتضانه في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف لمدة 15 دقيقة.
   2. لإخماد التفاعل ، أضف 1.25 M glycine إلى التركيز النهائي البالغ 0.125 M واحتضانه في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف على الروك لمدة 5 دقائق.
3. اغسل الخلايا ب 5 مل من PBS البارد ثلاث مرات. استنشق محلول غسيل PBS النهائي وأضف 10 مل من PBS. اكشط الخلايا من قاع القارورة باستخدام مكشطة الخلية.
4. باستخدام ماصة سعة 10 مل ، اسحب PBS وتعليق الخلية وقم بتوزيع السائل بالكامل في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل. قم بتدوير الخلايا عند 500 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.

< p class = "jove_title" >6. تجزئة النوى

1. تحضير 10 مل من المخزن المؤقت للتجانس: 0.25 م من السكروز ، و 1 ملي مولار EDTA ، و 10 ملي مولار HEPES ، و 0.5٪ BSA عند درجة الحموضة 7.4. يضاف PMSF مباشرة قبل الاستخدام إلى تركيز نهائي 1 ملي مولار و 3 مل من المخزن المؤقت لتعليق النوى (0.1٪ Triton X-100 في PBS).
2. أضف 5 مل مخزن مؤقت للتجانس مباشرة إلى حبيبات الخلية وقم بتعليقه تماما. قم بالطرد المركزي للتعليق عند 500 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية ثم تخلص من المادة الطافية.
3. قم بتعليق الحبيبات في 5 مل من المخزن المؤقت للتجانس. استخدم خالط التفلون الزجاجي المحكم ، وقم بتجانس الخلايا بمعدل 10 ضربات / 500 دورة في الدقيقة.
قم
4. بالطرد المركزي للتعليق عند 1,500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم تخلص من المادة الطافية
   ملاحظة: استخدم المادة الطافية لعزل الميتوكوندريا عن طريق الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق.
5. الحبيبات في 1 مل من المخزن المؤقت المعلق للنوى واحتضانها على الجليد لمدة 10 دقائق.
6. جهاز طرد مركزي بحجم 600 × جم لمدة 10 دقائق.
7. قم بتعليق الحبيبات في 1 مل من النوى المعزولة المعزولة والطرد المركزي مرة أخرى. تخلص من المادة الطافية. ستكون الحبيبات النهائية عبارة عن نوى معزولة.

< p class = "jove_title" >7. استخراج البروتين

1. كرر القسم 4 ، باستثناء إضافة 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل 1x مباشرة إلى حبيبات الخلية ثم تعليقها.

< p class = "jove_title" >8. إعداد العينة

1. قم بإعداد عينتين ل SDS-PAGE عن طريق أخذ 10 ميكرولتر لكل من مستخلص البروتين القابل للذوبان وإضافة 10 ميكرولتر من 2x Laemmli SDS-عينة و 1 ميكرولتر من 2-Mercaptoethanol (BME).
2. سخني عينة واحدة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية والعينة الثانية لمدة 15 دقيقة عند 98 درجة مئوية لعكس الوصلة المتقاطعة للفورمالديهايد.

< p class = "jove_title" >9. تحليل SDS-PAGE

1. قم بإعداد 1 لتر من 1x Tris-glycine Running Buffer (25 ملي تريس ، 192 ملي جلايسين ، 0.1٪ (وزن / حجم) SDS).
2. قم بإعداد جهاز تشغيل SDS-PAGE.
   ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول صفحة TGX SDS مسبقة البث بنسبة 16٪. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن استخدام أي نسبة مئوية من الجل.
   1. وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، افتح العبوة التي تم تخزين الجل فيها وقم بإزالة الكاسيت.
   2. قم بإزالة المشط الذي يبطن الآبار والشريط من أسفل الكاسيت.
   3. ضع الجل في جهاز التشغيل.
   4. املأ الغرفة بمخزن مؤقت 1x حتى تغمر الآبار في السائل. باستخدام ماصة بلاستيكية ، اشطف الآبار باستخدام المخزن المؤقت الجاري.
3. قم بتحميل العينات على الجل مع علامة قياسية ملطخة مسبقا 10 ميكرولتر.
4. قم بتشغيل الجل على 200 فولت حتى تصبح مقدمة الصبغة على بعد 1 سم تقريبا من أسفل الجل.

المواد