التركيز المتساوي الكهربي للمرحلة السائلة: تقنية الرحلان الكهربائي لفصل الجزيئات النشطة بيولوجيا عن مستخلص Gymnema sylvestre الخام

الملخص

المصدر: Veerapandian, R., et al. فصل الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا والببتيدات من المصادر الطبيعية والبروتينات من الميكروبات بطريقة التركيز المتساوي الكهربي التحضيري (IEF). J. Vis. Exp. (2020).

يصف هذا الفيديو تقنية لفصل الجزيئات المعقدة عن المستخلصات النباتية باستخدام التركيز المتساوي الكهربي للطور السائل. تساعد هذه التقنية في تنقية الجزيئات الحيوية المعقدة في حالتها الأصلية والتي يمكن استخدامها في العديد من التطبيقات النهائية.

البروتوكول

فئة < p = "jove_title" >1. فصل وتنقية الجزيئات الصغيرة والببتيدات من مستخلص Gymnema sylvestre

1. قم بقياس 0.6 جم من مستخلص النبات وقم بإذابه في الماء المقطر (60 مل) عن طريق الخلط في أنبوب أسطواني لمدة 5 دقائق < br / > ملاحظة: يمكن استخدام أي عينة بيولوجية قابلة للذوبان وخالية من الملح للفصل والتنقية باستخدام أداة التركيز المتساوي الكهربي (IEF) ذات الطور السائل. يمكن استخدام العينات ذات تركيز الملح المؤقت حتى 10 ملي مولار بدقة أقل قليلا.
2. جهاز الطرد المركزي المستخلص النباتي المذاب عند 10,000 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة الجسيمات غير القابلة للذوبان.
3. انقل المادة الطافية (~ 60 مل) إلى أنبوب طرد مركزي سعة 80 مل واخلطها مع 0.6 مل من الأمفوليت (درجة الحموضة 3-10) إلى 1٪ (حجم / حجم).
4. تحضير وحدة IEF ذات المرحلة السائلة.
   1. قم بتجميع أقطاب IEF ذات الطور السائل (زر الأنود الأحمر وزر الكاثود الأسود) مع أغشية التبادل الخاصة بها وفقا لدليل التعليمات (جدول المواد). موازنة أغشية تبادل الأنيون مع 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم وأغشية التبادل الكاتيوني مع 0.1 M H₃PO₄ لمدة 16 ساعة على الأقل عند استخدام أغشية جديدة.
   2. قم بتخزين الأغشية في الإلكتروليتات (0.1 M هيدروكسيد الصوديوم أو 0.1 م H₃PO₄) بين الجري ولا تسمح لها بالجفاف.
   3. قم بتجميع الجزء الداخلي والخارجي من القطب عن طريق محاذاة ثلاثة ثقوب مستطيلة في حشوات التبادل الأيوني. املأ الأقطاب الكهربائية بالإلكتروليتات المعنية (~ 25-30 مل) لمنع جفاف أغشيتها.
   4. لا تضيف الإلكتروليت الزائد (أكثر من 1/3 من حجم حجرة القطب) الذي قد يؤدي إلى زيادة الضغط داخل القطب الكهربائي ويسبب التسرب.
   5. قم بتغطية منافذ جمع العينات بشريط مانع للتسرب يأتي مع أجزاء تجميع الجهاز (جدول المواد). يمكن التعرف على جانب منافذ جمع العينات من خلال دبابيس محاذاة المعدن الرأسي. بدلا من ذلك ، استخدم شريط مانع للتسرب القياسي لإغلاق المنافذ.
   6. قم بتجميع جميع أجزاء مجموعة غرفة التركيز بالتسلسل (قطب الأنود ، قلب غشاء النايلون ، غرفة التركيز وقطب الكاثود) فوق إصبع التبريد الخزفي.
   7. املأ حجرة التركيز بالماء المقطر المبرد مسبقا (الحجم الإجمالي 60 مل لخلية IEF القياسية) باستخدام حقنة سعة 50 مل.
   8. قم بتوصيل أداة IEF ذات الطور السائل بمياه تبريد متداولة عند 4 درجات مئوية وقم بتشغيل الوحدة مسبقا عند 15 واط و 3,000 فولت لمدة 3-5 دقائق أو حتى يستقر الجهد.
      ملاحظة: بشكل عام ، في غضون دقيقة واحدة ، سيصل الجهد إلى الحد الأقصى للقيم المحددة. يساعد التشغيل المسبق بالماء المقطر على إزالة الأيونات المتبقية من غرفة التركيز وقلب غشاء النايلون.
   9. قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة وإزالة الماء من الخلية باستخدام مجمع الكسور. أعد إغلاق منافذ التجميع بشريط مانع للتسرب. الغرفة جاهزة الآن لتحميل العينة.
5. استخدم حقنة سعة 50 مل بإبرة نهاية حادة 1-1 / 2 بوصة 19 جم (تأتي مع الأداة) وقم بتحميل العينة المحضرة بأمفوليت (إجمالي 60 مل) في الخلية من خلال منافذ جمع العينات.
6. قم بإزالة فقاعات الهواء من خلية العينة عن طريق إزالة خلية التركيز البؤري من الحامل والنقر على حجرة القطب الكهربائي لإخراج الفقاعات. سيؤدي وجود فقاعات الهواء إلى تقلبات الجهد والتيار ويؤثر على التشغيل.
7. قم بتوصيل الوحدة بسائل تبريد الماء (4 درجات مئوية) وابدأ التجزئة بمصدر طاقة ثابت 15 واط.
8. قم بتشغيل الجهاز لمدة 3 ساعات أو حتى يصل الجهد إلى قيمة ثابتة.
   ملاحظة: عندما تبدأ العينة في التركيز ، سيبدأ الجهد في الصعود تدريجيا حتى يصل إلى قيمة ثابتة.
9. بعد التشغيل ، استعد لجمع الكسور الموجودة في صندوق الحصاد (التي تحتوي على 20 أنبوبا بلاستيكيا ، 12 مم × 75 مم ، حجم 5-6 مل) متصلة بمضخة التفريغ عن طريق الضغط على زر الحصاد في وحدة IEF.
10. قم بمحاذاة 20 دبابيس المجموعة مع 20 منفذا للتجميع لخلية التركيز البؤري المختومة بالشريط.
11. ادفع دبابيس التجميع من خلال شريط الختم وقم بتشغيل مضخة التفريغ في وقت واحد (الشكل 1B و 1C و 1D).
    ملاحظة: سيتم جمع حوالي 3 أجزاء مل من كل غرفة في الأنابيب في كل مرة. يمكن استخدام الكسور للتطبيقات النهائية اللاحقة (SDS-PAGE للقياس الكمي للببتيد ، TLC والمقايسة الحيوية للجزيئات الصغيرة).

النتائج

p class = "jove_content" >
الشكل 1: إعداد جهاز IEF في المرحلة السائلة وتجزئة G. مستخلص نبات سيلفستر. (أ) أثناء التشغيل ، (ب) أثناء جمع الكسور ، (ج) بعد جمع الكسور ، و (د) أجزاء جهاز IEF للطور السائل ، 1) أغشية التبادل الأيوني ، 2) غرفة التركيز وقلب الغشاء ، 3) تجميع القطب الكهربائي (سلبي) ، 4) تجميع القطب الكهربائي (موجب).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر فيشر ساينتفيك 09-720-004 بيو لايت 3/10 أمفوليت بيو راد 163-1113 بيو لايت 5/8 أمفوليت بيو راد 163-1192 ترموستات ضغط منخفض الحرارة لاودا -برينكمان RM 6T اضبط تبريد الماء على 4 درجات مئوية ويمكن تشغيله حتى عند 0 درجة مئوية كما هو الحال عندما يمر عبر قلب التبريد Rotofor ، ستكون درجة حرارة الماء المتداول حوالي 5 أو أكثر حسب الجهد. مسحوق مستخلص أوراق نبات Gymnema (>25٪ أحماض الجمباز) سوان فارما ، نيوجيرسي الولايات المتحدة الأمريكية الرحلان الكهربائي البروتيني الصغير بيو راد مقياس الأس الهيدروجيني ميتلر توليدو S20 مفيد لتحديد الرقم الهيدروجيني لكسور Rotofor (IEF ذات الطور السائل) روتوفور بيو راد 170-2972 http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (دليل تعليمات Rotofor لتجميع الوحدة) RPMI-1640 متوسط HyClone DH30255.01 شريط الختم بيو راد 170-2960 يمكن أيضا استخدام شريط سكوتش جهاز الطرد المركزي Sorvall legend micro 17 حراري علمي 75002432