الرحلان الكهربائي الشعري لتقارب تحول الحركة: طريقة لتحليل تفاعلات العينة والترابط اعتمادا على الهجرة التفاضلية لمجمعات البروتين والترابط

الملخص

المصدر: Nachbar M. et al. ، تحليل الاضطراب الجوهري AtHIRD11 والارتباط تجاه أيونات المعادن عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام الشعري والتقارب الكهربائي الشعري. J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو طريقة تحليل تفاعل البروتين والترابط عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري للتقارب المتنقل. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوصيف سلوك الارتباط للبروتين بروابط مشحونة مختلفة.

البروتوكول

1. قم بإعداد الحلول لتحليل ACE

1. تحضير محلول هيدروكسيد الصوديوم 1 م.
   1. يزن 4.0 جم من هيدروكسيد الصوديوم في قارورة حجمية سعة 100 مل.
   2. املأها حتى العلامة بالماء منزوع الأيونات لعمل مخزون 1 متر.
2. تحضير حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك 0.1 M (EDTA) في محلول هيدروكسيد الصوديوم 0.1 م.
   1. انقل 10 مل من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم في قارورة حجمية سعة 100 مل باستخدام ماصة لمبة سعة 10 مل. املأها حتى العلامة بالماء منزوع الأيونات.
   2. يزن 2.42 جم من EDTA على قارب وزن ويذوب المركب الصلب في 100 مل من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم.
3. قم بإعداد محلول Tris Buffer (30 ملم).
   1. أضف 3.63 جم من تريس ، و 200 مل من الماء منزوع الأيونات ، وشريط التحريك في دورق سعة 500 مل. ضع الدورق على طبق التحريك وقم بتشغيله.
   2. ضع قطبا كهربائيا لمقياس الأس الهيدروجيني في الدورق واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام 0.1 M HCl.
   3. املأ المحلول في قارورة حجمية سعة 1 لتر واملأها حتى العلامة بالماء منزوع الأيونات.
      ملاحظة: يجب تكرار هذا الإجراء أو الحاجة إلى قارورة حجمية أكبر نظرا لأن هناك حاجة إلى أكثر من 1 لتر للتحليل بأكمله.
4. قم بإعداد محلول علامة التدفق الكهربائي الأسيتانيليد (EOF) (60 ميكرومتر).
   1. أضف 6 ملغ من الأسيتانيليد و 100 مل من المخزن المؤقت Tris في قارورة حجمية سعة 100 مل.
   2. ضع القارورة الحجمية في حمام بالموجات فوق الصوتية وقم بتشغيلها لمدة 30 دقيقة.
5. تحضير محلول العينة (1 مجم / مل).
   1. ضع أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 مل على ميزان دقيق وأضف 0.3 مجم من مسحوق AtHIRD11 المجفف بالتجميد في الأنبوب.
   2. استخدم ماصة دقيقة لإضافة 0.3 مل من محلول ثلاثي 30 ملي مولار (الرقم الهيدروجيني 7.4) في الأنبوب. رج الأنبوب بعناية لإذابة البروتين.
6. تحضير محاليل الترابط.
   1. تحضير محلول مخزون CaCl₂ (5 ملم).
      1. خذ قارب وزن وضعه على ميزان تحليلي ووزن 36.76 مجم من CaCl₂ * H₂O.
      2. باستخدام ماصة دقيقة، اغسل CaCl₂*H₂O من قارب الوزن إلى قارورة حجمية سعة 50 مل باستخدام مخزن Tris المؤقت المعد مسبقا.
      3. املأ القارورة الحجمية بالمخزن المؤقت Tris حتى العلامة.
   2. تحضير محاليل المخزون المتبقية (5 ملم).
      1. كرر الخطوة 1.6.1 باستخدام الأملاح المعدنية الأخرى بدلا من CaCl₂ * H₂O [MgCl₂: 23.80 mg ، BaCl₂: 26.02 mg ، Sr (NO₃) ₂: 52.91 مجم ، MnCl₂: 31.46 مجم ، SeCl₄: 52.91 مجم ، CoCl₂ * 2H₂O: 41.47 مجم ، CuCl₂ * 2H₂O: 42.62 مجم ، ZnCl₂: 3.41 مجم ، و NiCl₂ * 6H₂O: 59.43 مجم].
         ملاحظه: يبلغ تركيز محلول ZnCl₂ 0.5 مل. نظرا لوحظ تفاعلات قوية بين الأيونات والجدار الشعري الداخلي ، تم تقليل التركيز بمعامل 10⁴.
   3. تحضير محلول 500 ميكرومتر CaCl₂.
      1. املأ 10 مل من محلول مخزون CaCl₂ وضعه في قارورة حجمية سعة 100 مل.
      2. املأ القارورة الحجمية بمخزن مؤقت Tris للعلامة وقم بهز القارورة.
   4. تحضير محلول 250 ميكرومتر CaCl₂.
      1. املأ 5 مل من محلول مخزون CaCl₂ وضعه في قارورة حجمية سعة 100 مل.
      2. املأ القارورة الحجمية بمخزن مؤقت Tris للعلامة وقم بهز القارورة.
   5. كرر الخطوات السابقة لحلول المخزون الأخرى.
7. املأ المحاليل في القوارير.
   ملاحظه: يحتاج كل تشغيل متكرر إلى مجموعة من قوارير المدخل والمخرج. يقلل استخدام محاليل الترابط الجديدة عند المدخل والمخرج من التحولات في وقت الترحيل بعد كل تشغيل.
   1. املأ محلول 250 ميكرومتر CaCl₂ في حقنة سعة 10 مل.
   2. ضع مرشح PVDF 0.22 ميكرومتر على المحقنة وادفع 2 مل من المحلول عبر الفلتر باستخدام المحقنة للتخلص من هذا المحلول المصفى.
   3. املأ 10 قوارير حتى الحد الأقصى المسموح به بمحلول CaCl₂ المتبقي من المحقنة 250 ميكرومتر. ضع علامة على كل منها على أنها قارورة مدخل محلول CaCl₂ 250 ميكرومتر.
   4. املأ 10 قوارير حتى تمتلئ نصفها بمحلول 250 ميكرومتر CaCl₂. ضع علامة على كل منها على أنه قارورة مخرج محلول CaCl₂ 250 ميكرومتر.
   5. كرر الخطوات 1.7.1 - 1.7.4 للمحاليل الأخرى المحتوية على الملح المعدني.
   6. كرر الخطوات لكل زوج من قوارير المدخل والمخرج باستخدام محلول 30 ملي مولار Tris المؤقت (درجة الحموضة 7.4) بدلا من ذلك.
      ملاحظه: يتم استخدام الرقم الهيدروجيني المخزن المؤقت 30 مليمول / لتر تريس 7.4 بين الجولات للحصول على بيانات وقت الهجرة للبروتين في حالة عدم وجود أيونات معدنية. من الضروري إهمال التغييرات في EOF.
   7. كرر الخطوات المذكورة أعلاه لقارورة واحدة باستخدام محلول علامة الأسيتانيليد EOF (60 ميكرومتر) بدلا من ذلك. كرر أيضا هذه الخطوات باستخدام محلول العينة (1 مجم / مل) بدلا من ذلك.

< p class = "jove_title" >2. التقارب التحليل الكهربي الشعري

1. تكييف الشعيرات الدموية
   1. اضبط منظم الحرارة على 23 درجة مئوية
      ملاحظه: يتم استخدام درجة الحرارة وفقا للبروتوكولات المنشورة ويمكن تغييرها إلى درجات حرارة أخرى. ومع ذلك ، فإن التفاعلات تعتمد على درجة الحرارة وستتغير وفقا لذلك.
   2. اغسل الشعيرات الدموية لمدة 40 دقيقة عند 2.5 بار باستخدام 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم.
   3. اغسل الشعيرات الدموية لمدة 10 دقائق عند 1.0 بار بالماء منزوع الأيونات.
   4. اغسل الشعيرات الدموية لمدة 30 دقيقة عند 1.0 بار باستخدام عازلة 30 ملي مولار (درجة الحموضة 7.4).
2. التحضير لطرق ACE
   1. جهز طريقة القياسات بدون روابط.
      ملاحظه: لم تتم إضافة الأسيتانيليد إلى محلول العينة ، لأنه يخفي 2 قمم بروتين.
      1. اشطف الشعيرات الدموية لمدة دقيقة واحدة عند 2.5 بار بمحلول EDTA 0.1 M.
      2. اشطف الشعيرات الدموية لمدة دقيقة واحدة عند 2.5 بار بالماء منزوع الأيونات.
      3. اشطف الشعيرات الدموية لمدة 1.5 دقيقة عند 2.5 بار باستخدام عازلة تريس للتوازن.
      4. حقن محلول الأسيتانيليد لمدة 6 ثوان عند 0.05 بار وقم بتغيير قوارير المدخل والمخرج إلى قوارير Tris العازلة.
      5. ضع 0.05 بار لمدة 2.4 ثانية لدفع محلول الأسيتانيليد من طرف الشعيرات الدموية إلى الداخل.
      6. ضع 10.0 كيلو فولت لمدة 6 دقائق واكتشف ذروة الأسيتانيليد بطول موجي 200 نانومتر.
      7. كرر الخطوات 2.2.1.1. - 2.2.1.6. باستخدام عينة البروتين بدلا من محلول الأسيتانيليد واكتشاف جميع قمم البروتين.
   2. تحضير طريقة القياسات باستخدام الروابط.
      1. اشطف الشعيرات الدموية لمدة دقيقة واحدة عند 2.5 بار بمحلول EDTA 0.1 M.
      2. اشطف الشعيرات الدموية لمدة دقيقة واحدة عند 2.5 بار بالماء منزوع الأيونات.
      3. اشطف الشعيرات الدموية لمدة 1.5 دقيقة عند 2.5 بار بمحلول الترابط للتوازن.
      4. حقن محلول الأسيتانيليد لمدة 6 ثوان عند 0.05 بار وقم بتغيير قوارير المدخل والمخرج إلى قوارير العازلة المحتوية على الترابط.
      5. ضع 0.05 بار لمدة 2.4 ثانية لدفع محلول الأسيتانيليد من طرف الشعيرات الدموية إلى الداخل.
      6. ضع 10.0 كيلو فولت لمدة 6 دقائق واكتشف ذروة الأسيتانيليد بطول موجي 200 نانومتر.
      7. كرر الخطوات 2.2.2.1 - 2.2.2.6 باستخدام عينة البروتين بدلا من محلول الأسيتانيليد واكتشف جميع قمم البروتين.
   3. كرر بالتناوب الخطوتين 2.2.1 و 2.2.2 من أجل حساب التغيير في نسب حجم الشحنة لمختلف تفاعلات أيون البروتين والمعدن.
      1. قم بتغيير محلول البروتين بعد كل 60 ساعة إلى محلول جديد.
         ملاحظه: في هذه المرحلة ، يمكن إيقاف التجربة مؤقتا. يتكرر هذا الإجراء 10x على الأقل لكل تركيز من الروابط لأن نمط الذروة يختلف قليلا من تشغيل إلى آخر. إذا تم استخدام المحلول لفترة أطول من 60 ساعة ، تصبح الاختلافات كبيرة جدا.

المواد