الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد ثنائي الأبعاد: تقنية فصل لتحليل البروتينات في خليط البروتين المركب بناء على الشحنة والوزن الجزيئي

الملخص

المصدر: Zhan, X., et al. الرحلان الكهربائي الهلامي ثنائي الأبعاد إلى جانب طرق قياس الطيف الكتلي لتحليل بروتين أنسجة الورم الحميد في الغدة النخامية البشرية J. Vis. Exp. (2018)

< p class = "jove_content">في هذا الفيديو ، نوضح طريقة الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد التي تفصل البروتينات الفردية عن خليط بروتيني معقد يتم الحصول عليه من أنسجة الورم الورمي الحميد النخامي البشري غير الوظيفي (NFPA). يتم فصل البروتينات بناء على شحنتها الكهربائية في البعد الأول ويتم فصلها بشكل أكبر بناء على الأوزان الجزيئية في البعد الثاني.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير العينات

1. جمع أنسجة الورم الحميد في الغدة النخامية (0.2 - 0.5 مجم) من قسم جراحة الأعصاب. قم بتجميدها على الفور في النيتروجين السائل ، ثم انقله إلى -80 درجة مئوية للتخزين.
2. أضف 2 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم في الماء المقطر منزوع الأيونات (ddH₂O). استخدم هذا المحلول لغسل الدم برفق من سطح الأنسجة (3x).
   NOTE: يتم استخدام ddH₂O مع موصلية 18.2 MΩ / cm في جميع أنحاء البروتوكول. قد تفقد بعض الأنسجة عند غسل الدم من سطح الأنسجة.
3. أضف حجما (10 مل ؛ 4 درجات مئوية) من المحلول الذي يحتوي على 2 M حمض الخليك و 0.1٪ (v / v) β-mercaptoethanol لكل 0.5 - 0.6 غرام من الأنسجة ، وتجانس (1 دقيقة ، 13،000 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية ، 10x) مع مجانس الأنسجة ، صوتنة التجانس لمدة 20 ثانية ، تجميد ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
4. قم بقياس محتوى البروتين في العينات المجففة بالتجميد والمتجانسة باستخدام مجموعة مقايسة حمض البيسنجونينيك (BCA><). ملاحظه: القياس الكمي BCA ليس تقديرا كميا مطلقا ، وسيتم تغيير النتيجة المقاسة باستخدام فني مختلف ووكيل تجريبي. يجب استخدام معيار عينة تركيز ثابت لتجارب مختلفة. لذلك ، سيتم تحديد كمية التحميل النهائية للبروتينات لكل هلام ثنائي الأبعاد باستخدام صورة جيدة الدقة الملطخة بالفضة أو الملطخة بالكوماسي في التجارب المصممة مسبقا.
   1. أضف حوالي 300 ميكروغرام من العينة المتجانسة المجففة بالتجميد إلى حجم واحد (282 ميكرولتر) من المخزن المؤقت لاستخراج البروتين (8 M اليوريا و 4٪ CHAPS) ، متبوعا بالوقوف لمدة ساعتين ، صوتنة في حمام مائي لمدة 5 دقائق ، بالتناوب لمدة ساعة واحدة ، صوتنة مرة أخرى في الحمام المائي لمدة 5 دقائق ، بالتناوب مرة أخرى لمدة 1 ساعة ، والطرد المركزي عند 15,000 × جم لمدة 20 دقيقة.
   2. تحضير المحاليل القياسية BSA بتركيزات كما هو مذكور: 0 ، 25 ، 125 ، 250 ، 500 ، 750 ، 1,500 ، 2,000 ميكروغرام / مل مع معيار BSA التجاري (2 مجم / مل).
   3. امزج كاشف BCA A و B (A: B = 50: 1) كحل عمل BCA قبل الاستخدام.
   4. أضف 0.1 مل من العينة أو المحلول القياسي إلى 2 مل من محلول عمل BCA في أنبوب ميكرو فوج ، متبوعا بالخلط ثم التحضين عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أخيرا ، تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق وقم بقياس قيمة OD_{562 نانومتر}.
   5. احسب الخط الخطي القياسي (A_{562 نانومتر} مقابل تركيز BSA) للحصول على معادلة انحدار لحساب محتوى بروتين العينة بقيمة_{A 562 نانومتر}.
5. استخدم 150 ميكروغرام من العينة المجففة بالتجميد المكافئة للبروتين لتلوين الفضة ، أو 500 ميكروغرام من البروتين لتلوين Coomassie ، لشريط تدرج الأس الهيدروجيني (IPG) 18 سم درجة الحموضة 3-10 غير خطي (NL).
   ملاحظه: يبلغ سمك الشريط الجاف IPG 0.5 مم وعرضه 3 مم ، بأطوال مختلفة بما في ذلك 7 و 11 و 13 و 18 و 24 سم ، ونطاقات مختلفة من الأس الهيدروجيني بما في ذلك الأس الهيدروجيني 4-5 و 4-7 و 6-9 و 3-10 في تدرج الأس الهيدروجيني الخطي أو غير الخطي. يجب أن يتناسب المخزن المؤقت IPG المستخدم مع الشريط.
6. أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج (7 M urea ، 2 M thiourea ، 4٪ (w / v) CHAPS ، 100 mM DTT (أضف قبل الاستخدام) ، 0.5٪ حجم / حجم فارماليت (أضف قبل الاستخدام) ، وأثر من البروموفينول الأزرق).
7. حافظ على المحلول أقل من 30 درجة مئوية ، متبوعا بالدوامة لمدة 5 دقائق ، والصوتنة لمدة 5 دقائق ، والتناوب لمدة 50 دقيقة.
8. أضف 110 ميكرولتر من محلول الإماهة (7 M urea ، 2 M thiourea ، 4٪ (w / v) CHAPS ، 60 mM DTT (أضف قبل الاستخدام) ، 0.5٪ حجم / حجم IPG المؤقت (أضف قبل الاستخدام) ، وأثر من البروموفينول الأزرق). سونيكات لمدة 5 دقائق. ثم قم بتدوير العينة لمدة 50 دقيقة ، والدوامة لمدة 5 دقائق ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة عند 15,000 × جم.
9. اجمع المادة الطافية (350 ميكرولتر) كمحلول عينة البروتين.

< p class = "jove_title" >2. الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد

1. IEF (البعد الأول): قم بإجراء IEF على نظام التركيز متساوي الكهرباء كما هو موضح أدناه.
   1. أضف 350 ميكرولتر من محلول عينة البروتين في فتحة حامل شريط IPG مقاس 18 سم.
   2. ضع شريط IPG مقاس 18 سم بحيث يكون الجانب لأسفل على محلول عينة البروتين (تجنب الفقاعات).
   3. أضف 3-4 مل من الزيت المعدني لتغطية شريط IPG.
   4. قم بتجميع حامل شريط IPG في نظام التركيز المتساوي الكهربي مع الطرف المدبب على اللوحة الخلفية (+) والطرف المربع على اللوحة الأمامية (-).
   5. أعد الترطيب طوال الليل (~ 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة).
   6. اضبط معلمات IEF: الحد الأقصى للتيار 30 ميكروأمبير لكل شريط ، 20 درجة مئوية ؛ 250 فولت ، 1 ساعة ، 125 فولت في الساعة ، الخطوة والاستمرار ؛ 1,000 فولت ، 1 ساعة ، 500 فولت في الساعة ، التدرج ؛ 8,000 فولت ، 1 ساعة ، 4,000 فولت في الساعة ، التدرج ؛ 8,000 فولت ، 4 ساعات ، 32,000 فولت في الساعة ، الخطوة والاستمرار ؛ و 500 فولت ، 0.5 ساعة ، 250 فولت في الساعة ، الخطوة والاستمرار. دعه يعمل حتى الوقت الإجمالي 7.5 ساعة و 36,875 فولت ساعة.
   7. بعد IEF ، أخرج كل شريط IPG وقم بإزالة الزيت المعدني الإضافي بمنشفة ورقية غير قابلة للذوبان. الآن لف الشريط في ورقة من غلاف بلاستيكي ، واحفظه في درجة حرارة -80 درجة مئوية < br / > ملاحظه: يجب تنظيف حامل الشريط IPG بمحلول تنظيف حامل الشريط IPG والماء المقطر.
2. SDS-PAGE (البعد الثاني): إجراء SDS-PAGE في نظام الرحلان الكهربائي للخلية العمودية
   ملاحظه: يجب أن يكون كل حجم جل SDS-PAGE 255 × 190 × 1 مم.
   1. استخدم عجلة متعددة الهلام لصب المواد الهلامية التي تعمل على حل PAGE بنسبة 12٪. لصب 12٪ من المواد الهلامية PAGE ، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
      1. أضف 270 مل من ddH₂O ، و 150 مل من 1.5 M Tris-HCl (درجة الحموضة 8.8) ، و 180 مل من محلول مخزون الأكريلاميد / البيساكريلاميد 40٪ (وزن / حجم) (29: 1 ، 40٪ وزن / حجم من الأكريلاميد و 1.38٪ وزن / حجم N ، N'-methylenebisacrylamide) ، 3 مل من 10٪ بيرسلفات الأمونيوم ، و 150 ميكرولتر من TEMED لصنع محلول الجل في دورق تخلط بلطف وتجنب الفقاعات.
      2. صب محلول الجل برفق في غرفة الصب المتعدد حتى ارتفاع الجل المتوقع (19 سم).
      3. أضف على الفور حوالي 3 مل ddH₂O على كل جل قابل للحل لتغطية المواد الهلامية. دع الجل يتبلمر لمدة 1 ساعة.
   2. تحضير 20 لترا من المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي (25 ملي تريس ، 192 ملي مولار جلسرين ، و 0.1٪ SDS). املأ خزان وحدة فصل الرحلان الكهربائي بالمخزن المؤقت هذا.
   3. أخرج شرائط IPG المركزة من الفريزر وقم بموازنة الشرائط لمدة 10 دقائق عن طريق التأرجح برفق في 4 مل من المخزن المؤقت لتقليل التوازن (375 ملي Tris-HCl (درجة الحموضة 8.8) ، 6 M urea ، 2٪ (وزن / حجم) SDS ، 20٪ (حجم / حجم) جلسرين ، 2٪ وزن / حجم DTT (أضف قبل الاستخدام) ، وأثر من البروموفينول الأزرق).
   4. قم بالتوازن لمدة 10 دقائق عن طريق هز شرائح IPG المخفضة برفق في 4 مل من محلول توازن الألكلة (375 ملي Tris-HCl (درجة الحموضة 8.8) ، 6 M اليوريا ، 2٪ (وزن / حجم) SDS ، 20٪ (حجم / حجم) جلسرين ، 2.5٪ وزن / حجم يودوأسيتاميد (أضف قبل الاستخدام) ، وأثر من البروموفينول الأزرق).
   5. أثناء توازن الهلام ، قم بتفكيك غرفة الصب المتعدد ، وأخرج كاسيت هلام الحل المعد. اشطف 3x باستخدام ddH₂O. قم بإزالة ddH₂O الزائد بمنشفة ورقية غير قابلة للذوبان وضعها في حامل جل.
   6. اشطف شرائط IPG المتوازنة باستخدام المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي وقم بإزالة السائل الزائد على سطح شريط IPG باستخدام المنشفة الورقية غير القابلة للذوبان.
   7. ضع شريط IPG على جل SDS-PAGE القابل للحل واترك الجانب البلاستيكي لشريط IPG يتصل باللوحة الزجاجية الأطول والطرف المدبب إلى اليسار.
   8. صب 3-4 مل من الاغاروز الساخن 1٪ في المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي SDS (~ 80 درجة مئوية) بسرعة لإغلاق شريط IPG في الجزء العلوي من كل جل SDS-PAGE ، ووضع الجانب العلوي من شريط IPG لأسفل إلى الجزء العلوي من اللوحة الزجاجية الأقصر بدون فقاعات ، ثم بلمرة لمدة 10 دقائق.
   9. أدخل كاسيت الجل المجمع عموديا بين الحشيات البلاستيكية في نظام الرحلان الكهربائي الرأسي. ضع الجزء العلوي من الجل مع شريط IPG بجوار الكاثود (-).
   10. اضبط مستوى المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي لغمر كاسيت الجل.
   11. قم بتوصيل وحدة إمداد الطاقة / التحكم واضبطها في وضع الجهد الثابت وقم بتشغيلها عند 200 فولت لمدة 370 دقيقة تقريبا أثناء مراقبة الصبغة.
   12. بعد التشغيل ، أخرج كاسيت الجل من نظام الرحلان الكهربائي ، وقم بإزالة الجل برفق من كاسيت الجل ، وتجنب تمزيق الجل ، متبوعا بتلوين البروتينات المنفصلة 2DE.

المواد