الرحلان الكهربائي للهلام بالزيموغرافيا: تقنية كهربائية للكشف عن البروتينات المعدنية المصفوفة من خلال تقييم النشاط الأنزيمي

الملخص

المصدر: Hu ، X. et al. ، الكشف عن البروتينات المعدنية المصفوفة الوظيفية بواسطة التصوير بالزيموغرافيا. J. Vis. Exp. (2010)

< p class = "jove_content">يوضح هذا الفيديو تقنية الرحلان الكهربائي للهلام الزيموغرافيا لتقييم نشاط البروتينات المعدنية المصفوفة (MMPs) الموجودة في طافي زراعة الخلايا. تعمل MMPs النشطة على تدهور الركيزة الخاصة ب MMP المضمنة في هلام بولي أكريلاميد ، والذي يظهر على شكل أشرطة شفافة على خلفية ملطخة داكنة بعد التلوين.

البروتوكول

1. تحميل وتشغيل الجل

1. يجب تحضير جميع العينات بشكل كاف للحفاظ على وظيفة الإنزيمات واستخدامها مباشرة بعد جمعها أو تخزينها مجمدة عند -80 درجة مئوية. يجب ألا تحتوي العينات على عوامل اختزال (مثل β-mercaptoethanol) أو يجب غليها قبل تحميل الجل.
2. افتح الحقيبة التي تحتوي على مادة هلامية داخل كاسيت ، واشطف الكاسيت بالماء منزوع الأيونات.
   1. قم بإزالة الشريط الواقي من أسفل الكاسيت والمشط من أعلى الجل.
   2. اشطف الآبار ثلاث مرات باستخدام عازل قيد التشغيل (مخفف إلى 1X في الماء منزوع الأيونات).
   3. ضع الجل في الخلية الصغيرة ، مع التأكد من أن الجانب الأصغر من الكاسيت متجها للداخل. ثبت في مكانه باستخدام إسفين التوتر الجلي. تسمح Mini-Cell بتشغيل واحد أو اثنين من المواد الهلامية بالتوازي.
   4. املأ الغرفة العلوية (الداخلية) بمخزن مؤقت 1X فوق مستوى الآبار ، وتحقق من وجود أي تسريبات. في حالة حدوث تسريبات ، قم بإزالة المخزن المؤقت وأعد وضع الجل.
   5. املأ الغرفة السفلية بمخزن مؤقت للتشغيل 1X.
3. قم بتحميل 10 ميكرولتر من العلامة الجزيئية للبروتين في بئر واحد.
   1. امزج كمية متساوية من المخزن المؤقت لتحميل الهلام والعينة وقم بتحميلها في آبار الجل باستخدام أطراف تحميل الهلام (يتم تغييرها بين كل عينة). يمكن تحميل هذه الآبار بما يصل إلى 20 ميكرولتر إجمالا.
4. ضع الغطاء على الخلية الصغيرة وقم بتوصيل أسلاك القطب الكهربائي بمصدر الطاقة. قم بتشغيل مصدر الطاقة واضبطه على تشغيل 125 فولت ثابت لمدة 90 دقيقة. تحقق من تكوين فقاعات صغيرة على سلك الغرفة السفلية ، مما يشير إلى دوران التيار.
5. عند تشغيل الجل الأول ، راقب تقدم الترحيل كل 15 دقيقة ، باستخدام البروموفينول الأزرق المضمن في مخزن التحميل كمؤشر. دع الجل يعمل حتى تصل صبغة المؤشر إلى قاع الجل.

< p class = "jove_title" >2. إعادة تشكيل وتطوير الجل

1. لكل هلام، قم بإعداد 100 مل من المخزن المؤقت لإعادة التشكيل 1X و 200 مل من المخزن المؤقت لتغيير الطبيعة، وكلاهما في الماء منزوع الأيونات.
2. عندما تصل صبغة التتبع الزرقاء البروموفينول إلى قاع الجل ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة ، وافتح الخلية الصغيرة ، وقم بإزالة الجل. افصل جانبي الكاسيت باستخدام سكين الجل (أو ملعقة وزن). قطع زاوية لتحديد اتجاه الجل.
3. قم بإزالة الجل بعناية من الكاسيت وضعه في وعاء به 100 مل عازل لإعادة التصميم. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف.
4. قم بإزالة المخزن المؤقت لإعادة التشكيل وأضف 100 مل من المخزن المؤقت النامي إلى الجل. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف.
5. قم بإزالة المخزن المؤقت النامي وأضف 100 مل أكثر من المخزن المؤقت النامي إلى الجل. احتضن بين عشية وضحاها (16-18 ساعة) عند 37 درجة مئوية.
6. قم بإزالة المخزن المؤقت النامي واشطفه ثلاث مرات (5 دقائق لكل منهما) بالماء منزوع الأيونات تحت تحريك لطيف في درجة حرارة الغرفة.
7. امسح الجل ضوئيا لحفظ الوضع الدقيق للأشرطة القياسية للبروتين لأنها ستصبح أقل وضوحا أو غير مرئية بعد تلطيخ الجل.
8. قم بتلطيخ الجل بإضافة 20 مل من SimplyBlue Safestain إلى الجل. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة تحت تحريض لطيف.
9. قم بإزالة SimplyBlue SafeStain وإزالة بقع الجل في 100 مل أو أكثر من الماء منزوع الأيونات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة تحت تقليب لطيف.
10. للحصول على نتائج أفضل ، استبدلها بالماء العذب منزوع الأيونات واحتضانها لمدة ساعة أخرى أو أكثر في درجة حرارة الغرفة تحت تحريك لطيف.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات جهاز الرحلان الكهربائي لعلامة Xcell SureLock Mini-Cell CE إنفيتروجين EI0001 مصدر الطاقة (موديل 302) VWR 93000-744 جل الزيموغرام الجيلاتين 10٪ من Novex ، 1.0 مم ، 12 بئرا إنفيتروجين EC61752BOX المخزن المؤقت لتحميل جل العصير الأزرق إنفيتروجين 10816015 نصائح تحميل الجل VWR 53509-015 معيار الوزن الجزيئي للبروتين إنفيتروجين ال سي 5800 عازلة تشغيل Novex Tris-Glycine-SDS إنفيتروجين ال سي 2675 المخزن المؤقت لتجديد الوزيموغرام Novex إنفيتروجين ال سي 2670 المخزن المؤقت لتطوير الوزيموغرام Novex إنفيتروجين ال سي 2671 SimplyBlue SafeStain إنفيتروجين ال سي 6060