مقالة منهجية

مقايسة الخبعة المناعية متعددة التحليلات: تقنية المقايسة المناعية القائمة على التدفق للكشف المتزامن عن أنواع فرعية متعددة من الأجسام المضادة في عينة المصل البشري

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Fhied، C. L. et al.، المراقبة الديناميكية للتحويل المصلي باستخدام مقايسة الخرزة المناعية متعددة التحليلات ل Covid-19. J. Vis. إكسب. (2022).

يصف هذا الفيديو تقنية المقايسة المناعية باستخدام حبات مغناطيسية فلورية أو كريات مجهرية مقترنة بمستضدات مختلفة للكشف في وقت واحد عن الأنماط التماثلية المختلفة للأجسام المضادة في عينة المصل. المفيعين في فهم التحول المصلي أثناء العدوى أو بعد التطعيم.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الكريات المجهرية المترافقة بالمستضد

  1. حدد ثلاث قوارير مختلفة من الكرات المجهرية المغناطيسية مع مناطق حبة فريدة ، وتسجيل معرف الخرزة ومعلومات الدفعة لكل قارورة مستخدمة.
    ملاحظه: سيتم اتباع الخطوات التالية لكل منطقة مجهرية متميزة. الكريات المجهرية حساسة للضوء ويجب حمايتها من التعرض الطويل للضوء. أثناء خطوات الغسيل ، احرص على عدم إزعاج الكريات المجهرية. إذا تم إزعاجك ، اسمح بفصل ثان لمدة 60 ثانية.
  2. دوامة مخزون الكرة المجهرية لمدة 60 ثانية والصوتنة لمدة 5 دقائق قبل استخدامها لفصل الخرز المجمع.
  3. نقل 1.0 × 106 حبات إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة ملزمة منخفضة البروتين سعة 1.5 مل.
  4. أدخل الأنبوب في فاصل مغناطيسي واترك الانفصال يحدث لمدة 60 ثانية. مع بقاء الأنبوب في الفاصل المغناطيسي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخرزة.
  5. قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي ، وأعد تعليق الخرزات ب 100 ميكرولتر من الماء من درجة HPLC ، والدوامة لمدة 30 ثانية. ضع الأنبوب مرة أخرى في الفاصل المغناطيسي لمدة 60 ثانية ، ثم قم بإزالة المادة الطافية لاحقا. كرر بروتوكول الغسيل هذا مرتين.
  6. قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الكريات المجهرية المغسولة في 90 ميكرولتر من فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة 100 ملي مولار ، درجة الحموضة 6.2 (عازلة التنشيط) بواسطة الدوامة لمدة 30 ثانية.
  7. أضف 10 ميكرولتر من 50 مجم / مل Sulfo-NHS (مخفف بمحلول التنشيط) إلى الكريات المجهرية والدوامة برفق لمدة 10 ثوان أضف 10 ميكرولتر من محلول EDC 50 مجم / مل (مخفف بمحلول التنشيط) وقم باحتضان الكرات المجهرية لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع دوامة لطيفة كل 10 دقائق.
  8. كرر خطوات الغسيل 1.4-1.5 مع 50 ملي MES ، درجة الحموضة 5.0 (Coupling Buffer) بدلا من الماء من الدرجة LC / MS لإجمالي غسلتين.
  9. قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الخرزات ب 100 ميكرولتر من Coupling Buffer بواسطة دوامة لمدة 30 ثانية متبوعة على الفور بإضافة الكمية المطلوبة من البروتين.
  10. ارفع الحجم الإجمالي إلى 150 ميكرولتر باستخدام Coupling Buffer. امزج تفاعل الاقتران عن طريق الدوامة لمدة 30 ثانية واحتضانه لمدة ساعتين عن طريق الدوران عند RT.
    ملاحظه: بالنسبة للمقايسات المحددة هنا ، تم إجراء الاقترانات بتركيزات البروتين التالية: Spike S1: 5 μg ؛ نوكليوكابسيد: 5 ميكروغرام ؛ الغشاء: 12.5 ميكروغرام.
  11. كرر خطوة الغسيل 1.4 باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) -1٪ ألبومين مصل الماعز ، 0.01٪ بولي سوربات -20 (إخماد العازلة) بدلا من الماء من الدرجة LC / MS لإجمالي غسلتين. أعد تعليق الكريات المجهرية المغسولة في 100 ميكرولتر من Crych Buffer الذي يحتوي على 0.05٪ أزيد الصوديوم بواسطة الدوامة لمدة 30 ثانية
    ملاحظه: السماح للحبات بإخمادها بالكامل لمدة 6 ساعات على الأقل قبل الشروع في أي إجراء آخر.
  12. احسب عدد الكريات المجهرية المستردة باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس كثافة الدم. سجل تركيز الخرزة المرصود.
  13. قم بتبريد الكريات المجهرية المقترنة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
< p class = "jove_title" >2. الإجراءات

  1. أداء الفحص (البروتوكول الأساسي)
    1. قم بتعليق الكريات المجهرية المقترنة بواسطة الدوامة لمدة 30 ثانية والصوتنة لمدة ~ 60-90 ثانية.
    2. قم بإزالة الكمية المطلوبة من كل غروانية حبة من الأنبوب المعني واجمع الغرويات الخرزية في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل.
    3. أدخل الأنبوب في فاصل مغناطيسي واترك الفصل يحدث لمدة 60 ثانية. مع بقاء الأنبوب في الفاصل المغناطيسي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخرزة.
    4. قم بإزالة الخرزات من الفاصل ، وأعد تعليق الخرزات ب 100 ميكرولتر من ألبومين مصل الأبقار PBS-1٪ ، و 0.01٪ Polysorbate-20 (Assay Buffer) ، والدوامة لمدة 30 ثانية. ضع الأنبوب في فاصل مغناطيسي واترك الفصل يحدث لمدة 60 ثانية. كرر بروتوكول الغسيل هذا (أي الخطوات 2.1.3-2.1.4) مرتين.
    5. اضبط تركيز خليط الكرة المجهرية العامل 3-plex عن طريق إضافة حجم مناسب من Assay Buffer لتوليد تركيز نهائي يبلغ 100 كرة دقيقة لكل 1 ميكرولتر لكل هدف.
    6. Aliquot 12.5 ميكرولتر من خليط المجهرية المحضر في الخطوة 2.1.5 في كل بئر من صفيحة 384 بئرا أو 25 ميكرولتر في كل بئر من صفيحة 96 بئرا.
    7. قم بتخفيف عينات البلازما / المصل 500 مرة في Assay Buffer. تحضير العينات القياسية وفقا للمعايرة بالتحليل الحجمي المطلوبة.
    8. أضف 12.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص كعينة فارغة وأضف كل عينة أو معيار مخفف في كل بئر معين للوحة عينة مكونة من 384 بئرا أو 25 ميكرولتر من العينة الفارغة المخففة أو المعيار في كل بئر من لوحة عينة مكونة من 96 بئرا.
    9. قم بتغطية اللوحة بختم أو رقائق الألومنيوم واحتضانها لمدة 1 ساعة في RT على شاكر لوحة مضبوطة على 700 دورة في الدقيقة.
      ملاحظه: يتم توفير تخطيطي لمنحنيات التخفيف في الجدول 1.
    10. قم بإعداد محلول من الأجسام المضادة للكشف عن الإنسان (محاليل الأجسام المضادة الثانوية) عند 4 ميكروغرام / مل باستخدام المخزن المؤقت للفحص كما هو محدد في الخطوة 2.1.11.
    11. تحضير IgM المضاد للإنسان من الماعز ، مقترنا مع Super Bright 436 (SB) / Goat-anti-human IgA ، Phycoerythrin (PE) الأجسام المضادة للكشف عن الأجسام المضادة عند 4 ميكروغرام / مل ؛ أو IgM الماعز المضاد للإنسان ، SB المترافق / الماعز المضاد للإنسان IgG ، الأجسام المضادة للكشف عن PE المترافق عند 4 ميكروغرام / مل.
      ملاحظه: بالنسبة لتنسيق لوحة 384 بئرا ، يلزم 12.5 ميكرولتر / بئر من محلول الجسم المضاد الثانوي المحضر ، وبالنسبة لتنسيق لوحة 96 بئرا ، يلزم 25 ميكرولتر / بئر.
    12. ضع اللوحة على فاصل مغناطيسي ، واغسلها بسرعة ، واقلبها بقوة فوق حاوية بيولوجية لإزالة السائل من الآبار. مع استمرار اللوحة مقلوبة ، اضغط بقوة على اللوحة على رزمة سميكة من الورق.
    13. اغسل كل بئر ب 100 ميكرولتر من Assay Buffer وقم بإزالة السائل عن طريق الانعكاس القوي فوق حاوية بيولوجية ، كما هو موضح سابقا. كرر هذه الخطوات (2.1.12-2.1.13) ليصبح المجموع غسلتين. تخلص من جميع حزم الورق المستخدمة في حاوية بيولوجية.
    14. أضف 12.5 ميكرولتر من محلول عمل الجسم المضاد الثانوي إلى كل بئر من صفيحة 384 بئرا أو 25 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة 96 بئرا. قم بتغطية اللوحة بختم أو رقائق الألومنيوم واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند RT على شاكر لوحة مضبوطة على 700 دورة في الدقيقة.
    15. كرر خطوات الغسيل 2.1.12-2.1.13.
    16. أضف 75 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص في كل بئر من صفيحة 384 بئرا أو 100 ميكرولتر في كل بئر من صفيحة 96 بئرا. قم بتغطية اللوحة بختم أو ورق ألومنيوم واحتضانها لمدة 5 دقائق عند RT على شاكر لوحة مضبوطة على 700 دورة في الدقيقة.
    17. قم بتحليل 60 ميكرولتر عبر محلل الجهاز وفقا لدليل النظام.

الجدول 1: سلسلة التخفيف للمنحنيات القياسية: جدول عوامل التخفيف المستخدمة للمنحنيات القياسية للنمط المصلي IgG ؛ تم تقديمه كمنحنى تخفيف تسلسلي مكون من 7 نقاط ، 1: 5 يبدأ من 1 ميكروغرام / مل ل α-Spike S1 و α-Nucleocapsid و 5 ميكروغرام / مل للأجسام المضادة α الغشائية.

الرقم القياسي سلسلة التخفيف مضاد للارتفاع S1 أو N (ميكروغرام / مل) مضاد للغشاء (ميكروغرام / مل) خلبي خلبي - - 1 STD7 1: 1 1 5 2 STD6 1:5 0.2 1 3 STD5 1:25 0.04 0.2 4 STD4 1:125 0.008 0.04 5 STD3 1:625 0.0016 0.008 6 STD2 1: 3125 0.00032 0.0016 7 STD1 1: 15625 0.000064 0.00032

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 384 بئر ألواح البوليسترين الجانبية السوداء ثيرمو فيشر 12-565-346 مخزن التنشيط (0.1 M NaH2PO4 ، درجة الحموضة 6.2) أعدت في المنزل مخزن الفحص المؤقت (PBS ، 1٪ ألبومين مصل بقري ، 0.01٪ بولي سوربات -20) أعدت في المنزل ألبومين مصل الأبقار ، جزء الصدمة الحرارية MilliporeSigma أ -7888 - 50 جرام المخزن المؤقت للاقتران (50 ملي مولار MES ، الرقم الهيدروجيني 5.0) أعدت في المنزل COVID 19 M بروتين مصفوفة مؤتلف لفيروس كورونا (6xHistag) ماي بيوسورس MBS8574735 أطراف ماصة يمكن التخلص منها EDC (1-إيثيل -3- [3- ثنائي ميثيل أمينوبروبيل] كاربوديميد: هيدروكلوريد) ثيرمو فيشر PIA35391 ألبومين الماعز ، مسحوق الكسر الخامس ميليبور سيجما أ 2514-1 جي IgA الماعز المضادة للإنسان ، R-PE ، Polyclona ثيرمو فيشر OB205009 IgG الماعز المضادة للإنسان ، R-PE ، متعددة النسيلة ثيرمو فيشر OB204009 IgG الماعز المضادة للأرانب ، R-PE ، متعددة النسيلة ثيرمو فيشر OB403009 جي إم الماعز المضادة للإنسان ، R-PE ، متعددة النسيلة ثيرمو فيشر OB202009 IgM ماوس مضاد للإنسان ، SB 436 ، استنساخ SA-DA4 ثيرمو فيشر 62999842 محلل الأدوات شركة Luminex Corp. إنتيليفليكس - رو أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة الربط (1.5 مل) ثيرمو فيشر 13-698-794 MagPlex-C المجهرية ، المنطقة XXX شركة Luminex Corp. MC10XXX-01 هيدرات MES (2- (N-Morpholino) هيدرات حمض السلفونيك الإيثان) MilliporeSigma م 2933 شريط ختم الألومنيوم Microplate ثيرمو فيشر 07-200-683 بولي سوربات -20 ثيرمو فيشر بي ت 337-500 شركة الجودة البيولوجية PBS ، درجة الحموضة 7.2 ثيرمو فيشر 50-751-7328 المخزن المؤقت لإخماد (PBS ، 1٪ ألبومين مصل الماعز ، 0.01٪ بولي سوربات -20) أعدت في المنزل SARS-CoV-2 (2019-nCoV) بروتين نوكليوكابسيد (علامته) سينو بيولوجيز 40588-V08B SARS-CoV-2 (2019-nCoV) بروتين سبايك (الوحدة الفرعية S1 ، علامته) سينو بيولوجيز 40591-V08H SARS-CoV-2 (2019-nCoV) الجسم المضاد Spike RBD ، Rabbit pAb سينو بيولوجيز 40592-T62 SARS-CoV-2 (2019-nCoV) الأجسام المضادة للنوكليوكابسيد ، Rabbit mAb سينو بيولوجيز 40588-R0004 SARS-CoV-2 (COVID-19) الجسم المضاد الغشائي (IN) ، الأرانب pAb بروسكي 10-516 سلفو-NHS (N-هيدروكسي سلفوسوكسينيميد) ثيرمو فيشر PIA39269 عازلة الغسيل (PBS ، 0.01٪ بولي سوربات -20) أعدت في المنزل الماء ، درجة LC / MS ثيرمو فيشر دبليو -64

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة