$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
p class = "jove_title" >1. مجموعة الكائن
الحي
- جمع شقائق النعمان البحرية A. dowii.
ملاحظة: هنا ، تم جمع الكائنات الحية خلال فترات المد المنخفض في منطقة المد والجزر قبالة ساحل إنسينادا باجا ، كاليفورنيا ، المكسيك (الشكل 1 أ ، ب).
- انقل الكائنات الحية إلى المختبر في حاويات بها مياه البحر (الشكل 1 ج).
- في المختبر ، نظف الكائنات الحية بالماء المقطر يدويا لإزالة جزيئات الركيزة الكبيرة الملتصقة بالجسم.
قم - بتجميد الكائنات الحية على الفور عند -80 درجة مئوية في فريزر فائق لمدة 72 ساعة.
- ضع الكائنات الحية في أكواب خاصة للتجفيف بالتجميد ، مع ظروف تجميد -20 درجة مئوية ، 0.015 رطل لكل بوصة مربعة ، لمدة 48 ساعة.
- قم بتخزين الكائنات المجففة بالتجميد عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
< ص الفئة = "jove_title" >2. ترطيب الأنسجة
- أعد تكوين 20 جم من الوزن الجاف للكائنات المجففة بالتجميد مع 60 مل (1/3 واط / حجم) من 50 ملي مولار من فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.5 ، وقرص كوكتيل مثبط واحد (جدول المواد).
- في محرك مغناطيسي ، حرك العينة باستمرار عند ~ 800 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية ، لمدة 12 ساعة.
< p class = "jove_title" >3. إطلاق السموم
- للحث على تحلل الخلايا وتفريغ الكيسة الخيطية ، قم بتجميد العينة عند -20 درجة مئوية لمدة 12 ساعة ، ثم ضع الحاوية في الماء في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى تذوب حتى 90٪. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات.
ملاحظه: العينة لا تذوب بنسبة 100٪ ؛ من الأهمية بمكان الحفاظ على العينة عند ~ 4 درجة مئوية لمنع تدهور البروتين.
- لاحظ الكيسة الخيطية التي يتم تفريغها تحت المجهر متحد البؤر. خذ 10 ميكرولتر من العينة على شريحة وضع غطاء فوقها. المراقبة تحت المجهر متحد البؤر بتكبير 100x و 60x. هنا لم تكن الصبغة ضرورية.
- قم بمعالجة الصور الملتقطة في المجهر متحد البؤر في برنامج ImageJ (الإصدار 1.53c ، واين راسباند ، المعاهد الوطنية للصحة ، الولايات المتحدة الأمريكية ، https://imagej.nih.gov/ij).
- إذا انفصلت النبيبات الموجودة داخل الكيسة الخيطية وتكون في الخارج ، يتم تفريغ الأكياس الخيطية ؛ ثم تابع الخطوة التالية. خلاف ذلك ، قم بإجراء دورة تجميد وإذابة أخرى فقط.
- لتوضيح المستخلص ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 25,400 × جم لمدة 40 دقيقة ، 4 درجات مئوية ، واسترجع المادة الطافية ، وقم بطردها مرة أخرى. كرر هذه الخطوة 3-4 مرات.
- استرجع المادة الطافية وتخلص من الحبيبات. يحتوي المستخلص الطافي أو الخام على مكونات السم (السموم) وجزيئات الخلايا الأخرى ، مثل الدهون والكربوهيدرات والأحماض النووية.
< p class = "jove_title" >4. التقدير الكمي للبروتين الكلي
- تحديد تركيز البروتين للمستخلص الخام باستخدام مجموعة مقايسة برادفورد اللونية التجارية (جدول المواد).
- تمييع كاشف الصبغة (جزء واحد من الصبغة بأربعة أجزاء من الماء المقطر).
- تحضير محلول ألبومين مصل الأبقار (BSA) الكسر الخامس (جدول المواد) بتركيز 1 مجم / مل في مخزن الفوسفات (50 ملي فوسفات الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 7.5).
- قم بإعداد الحلول المدرجة في الجدول 1 بثلاث نسخ.
- اخلطي كل محلول بقوة في شاكر لمدة 4 ثوان.
- احتضان العينات لمدة 5 دقائق في RT ، دون رج.
- قياس الامتصاص (AU) عند 595 نانومتر.
- ارسم متوسطات عينة امتصاص BSA (AU مقابل تركيز البروتين) ، وحدد معادلة الرسم البياني (المعادلة 1).
حيث y هو الامتصاص ، m هو ميل الخط ، x هو تركيز البروتين ، و b هو تقاطع Y. لحساب تركيز المستخرج الخام ، قم بحل x على النحو التالي:
5. تحديد تعقيد سم عديد الببتيد
- قم بتجميع الحاوية الزجاجية للرحلان الكهربائي للهلام العمودي وفقا للدليل.
- تحضير مزيج الأكريلاميد (30٪): 29.2 غرام من مادة الأكريلاميد ، 0.8 غرام من ثنائي الأكريلاميد ، الحجم النهائي 100 مل. قم بتصفية المحلول باستخدام غشاء 0.45 ميكرومتر. قم بتخزين المحلول في زجاجة داكنة عند 4 درجات مئوية. ثم قم بإعداد الخليط للهلام المحلل (الجدول 2).
- يتكون جل SDS-PAGE من جل قابل للحل وجل تكديس. قم بإعداد المواد الهلامية وفقا لأحجام المحلول المحددة في الجدول 2. أثناء التحضير ، تأكد من الحفاظ على كل مزيج عند 4 درجات مئوية لتقليل وقت البلمرة.
ملاحظه: يختلف حجم كل خليط حسب العلامة التجارية للمعدات المستخدمة ؛ بالنسبة لهذا البروتوكول ، تتوافق الأحجام مع تحضير هلام الأكريلاميد بنسبة 15٪ ، بسمك 0.75 مم ، لغرفة الرحلان الكهربائي الرأسي (جدول المواد).
- بعد بلمرة مادة الأكريلاميد ، ~ 10 دقائق ، أضف خليط هلام التكديس.
- قم بإعداد الخليط لجل التكديس ، وأضفه على الفور إلى الألواح الزجاجية ، ثم ضع مشطا لتشكيل الآبار لتحميل العينات.
- بمجرد بلمرة جل التكديس (~ 15 دقيقة) ، قم بإزالة المشط وضع الحاوية الزجاجية في غرفة للرحلان الكهربائي الرأسي.
- ضع 200 مل من المخزن المؤقت للقطب الكهربائي (0.25 م تريس ، 0.192 م جلايسين ، 0.1٪ SDS) في غرفة الرحلان الكهربائي.
- تحليل المستخلص الخام: امزج 30 ميكروغرام من المستخلص الخام مع 5 ميكرولتر من محلول تحميل البروتين (25٪ جلسرين ، 15٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، 25٪ 2-ميركابتو إيثانول ، 0.125 ملي مولار تريس درجة الحموضة 7 ، بروموفينول أزرق 0.1 مجم / مل) لتغيير طبيعة البروتينات. يجب أن يكون الحجم النهائي <50 ميكرولتر.
- يسخن على حرارة 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ويبرد ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 3 ثوان عند 1,400 × جم. 10. قم بتحميل العينات في آبار هلام التراص. قم بتحميل سلم الوزن الجزيئي القياسي.
- قم بتحميل العينات في آبار هلام التكديس. قم بتحميل سلم الوزن الجزيئي القياسي.
- قم بتشغيل الرحلان الكهربائي عند ثابت 25 مللي أمبير لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة.
- قم بإزالة العبوات الزجاجية من غرفة الرحلان الكهربائي للمضي قدما في تلطيخ بروتينات الجل.
< ص class = "jove_title" >6. تلطيخ البروتين
- اشطف الجل بسعة 50 مل من الماء المقطر لإزالة الحطام من القطب الكهربائي العازل.
- تخلص من الماء.
- لتجنب انتشار بروتينات الهلام ، أضف محلول التثبيت (60 مل من الإيثانول ، و 20 مل من حمض الأسيتيك ، و 20 مل من الماء المقطر ، الحجم النهائي 100 مل). احتضن في RT لمدة 40 دقيقة مع الاهتزاز عند 80 دورة في الدقيقة. صب الحل.
- أضف محلول البروتين المتشابك (15 مل من الإيثانول ، 0.25 مل من الجلوتارالديهايد ، 50 مل من الماء المقطر ، الحجم النهائي 65.25 مل) ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة في RT مع الرج عند 80 دورة في الدقيقة. قم بإزالة المحلول.
- اغسل الجل ب 100 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة الماء. كرر هذا الإجراء أربع مرات.
- قم بتلطيخ البروتين باستخدام 50 مل من محلول Coomassie الأزرق اللامع R-250 المصفى (40٪ ميثانول ، 10٪ حمض الأسيتيك ، 50٪ ماء مقطر ، 0.1٪ صبغة ، الحجم النهائي 100 مل) ، مع التحريك عند 60 دورة في الدقيقة في مذبذب دوار مختبري عند RT لمدة 15 دقيقة.
- استرجع المحلول ، والذي يمكن استخدامه لتلطيخ المواد الهلامية الأخرى.
- للتخلص من الصبغة الزائدة ، أضف محلول إزالة البقع (40 مل من الميثانول ، 10 مل من حمض الأسيتيك ، 50 مل من الماء المقطر). استمر في التقليب (80 دورة في الدقيقة) عند RT حتى تظهر العصابات (البروتينات الملطخة).
- احتفظ بالجل في 50 مل من الماء المقطر وامسح الصورة ضوئيا في نظام توثيق Gel.
< p class = "jove_title" >7. فحص الفوسفوليباز
- اغسلي بيضة دجاج واحدة مع 1٪ SDS في الماء المقطر.
- افصل صفار البيض عن بياض البيض في ظروف معقمة.
- قم بإعداد 50 مل من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.86٪ ، وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. ثم قم بإعداد المحلول أ: أضف 12 مل من صفار البيض و 36 مل من محلول كلوريد الصوديوم 0.86٪.
- تحضير المحلول ب: امزج 300 مجم من الاغاروز في 50 مل من المخزن المؤقت (50 ملي تريس ، درجة الحموضة 7.5) ، قم بالترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. سخني المحلول في الميكروويف حتى الغليان. تبرد في ماء دافئ لتصل إلى 43-45 درجة مئوية.
- تحضير المحلول ج: قم بإعداد 10 ملي مولار من CaCl2 وقم بتصفيته بمرشح 0.22 ميكرومتر.
- تحضير المحلول D: 10 مجم من الرودامين 6G في 1 مل من الماء المقطر.
- في ظل ظروف معقمة (غطاء التدفق الرقائقي) ، أضف 500 ميكرولتر من المحاليل A و C إلى المحلول B و 100 ميكرولتر من المحلول D ، واخلط واسكب 25 مل في كل طبق بتري (90 × 15 مم).
- انتظر حتى يتصلب المحلول في ظل ظروف معقمة (30 دقيقة).
- اصنع آبا (~ 2-3 مم) بأنبوب رفيع.
- أضف ما مجموعه 20 ميكرولتر من مخزن الفوسفات المؤقت (التحكم السلبي) في بئر واحد و 20 ميكرولتر من الفوسفوليباز المحدد (التحكم الإيجابي) في بئر آخر.
- ضع كميات مختلفة من بروتين المستخلص الخام ، 5 ، 15 ، 25 ، 35 ، 45 ميكروغرام ، في الآبار المتبقية ، كل منها بحجم نهائي يبلغ 20 ميكرولتر.
- انتظر حتى يمتص الأجار جميع العينات (30 دقيقة).
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة.
- إذا تشكلت هالة حول البئر ، فهذا يشير إلى نشاط الفوسفوليباز. قم بقياس الهالة المتكونة من الفرجار الورني.
ملاحظه: قم بإجراء التجربة ثلاث نسخ (خطوات من 7.1-7.14).
