< p class = "jove_title" >1. تصنيع طوابع polydimethylsiloxane (PDMS)
- ارسم مجموعة من الحلقات المجهرية باستخدام برنامج CAD، بقطر داخلي يبلغ 250 ميكرومتر وقطر خارجي يبلغ 450 ميكرومتر. النمط المستخدم في هذا البروتوكول هو مصفوفة 10 × 10 بمسافة 850 ميكرومتر بين الحلقات.
- اطبع قناع شفاف للنمط بالدقة المطلوبة باستخدام خدمة طباعة الأقنعة الخاصة بشركة التصنيع الدقيق (انظر جدول المواد).
ملاحظه: ثبت أن الأبعاد المتوفرة للحلقة تعمل مع العديد من أنواع الخلايا.
- قم بإجراء الطباعة الحجرية الضوئية للأشعة فوق البنفسجية (UV) باستخدام القناع الذي يحتوي على الميزات المطلوبة لصنع قالب مقاوم للضوء سالب (مثل SU-8).
- قم بتغطية رقاقة السيليكون المطلية بمقاومة الضوء بواسطة قناع الشفافية المصنوع في الخطوات 1.1-1.2.
- على محاذاة ملامسة للأشعة فوق البنفسجية ، قم ببلمرة مقاومة الضوء تحت مناطق شفافة من القناع بواسطة ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظه: بعد مزيد من الغسيل والتطوير ، يتم تصنيع القالب الرئيسي بالميزات المرغوبة. تعتمد التفاصيل التشغيلية على المعدات المحددة المستخدمة.
- قم بإعداد البوليمرات المسبقة المرنة PDMS عن طريق الخلط مع عامل المعالجة الخاص بها بنسبة 10: 1 ثم صب الخليط على القالب في طبق بتري.
- ضع الطبق في حجرة مفرغة لمدة 30 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء في PDMS واخبزيه في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل.
- بعد المعالجة الكاملة ل PDMS ، قم بقص مصفوفات الأنماط إلى طوابع.
ملاحظه: قد يفضل استخدام الطوابع السميكة (حوالي 1 سم) نظرا لسهولة التعامل معها في الخطوات اللاحقة لطباعة التلامس الدقيق.
فئة < p = "jove_title" >2. طلاء الشرائح الزجاجية
- نظف الشرائح الزجاجية. انقع الشرائح في حمام الإيثانول بنسبة 100٪ ، وصوتي لمدة 5 دقائق ، ثم اشطفها بالماء.
- كرر هذه الخطوة أولا باستخدام الأسيتون ، ثم باستخدام الأيزوبروبانول ، متبوعا بالتجفيف في تيار النيتروجين.
- استخدم معدات تبخر شعاع الإلكترون (E-beam) لطلاء طبقات التيتانيوم والذهب على شرائح زجاجية.
ملاحظه: بالنسبة لطبقة التيتانيوم ، فإن السماكة المطلوبة هي 15 Å (1 Å = 10-10 م). بالنسبة للطبقة الذهبية ، السماكة المطلوبة هي 150 Å. قم بتغطية التيتانيوم أولا ثم الذهب ، حيث تعمل طبقة التيتانيوم كمادة لاصقة بين الذهب والشريحة الزجاجية.
- ضع الشرائح التي تم تنظيفها في غرفة التبخر وأدخل بوتقات الذهب والتيتانيوم تحت المصاريع.
- قم بضخ الغرفة لإنشاء فراغ أقل من 10-5 باسكال قبل صهر المعادن. ركز شعاع الإلكترون على المعدن واضبط الطاقة بحيث يكون معدل الترسيب مناسبا للتحكم في سمك الترسيب.
- افتح الغالق لبدء الترسيب المعدني. أغلق الغالق عند الوصول إلى السماكة المطلوبة.
- قم بتبديل البوتقات بين التبخر المتسلسل لمعدنين.
- انتظر حتى تبرد البوتقات كما هو مطلوب من قبل المعدات ، وتنفيس الغرفة ، وإخراج الشرائح الزجاجية المطلية بالذهب.
- ضخ الغرفة مرة أخرى لصيانة المعدات.
ملاحظه: قد تعتمد تفاصيل التشغيل على مبخر شعاع إلكتروني معين. من المهم وجود معدل إيداع منخفض ومنخفض للتيتانيوم. غالبا ما تؤدي طبقة التيتانيوم السميكة إلى ضعف الرؤية ، خاصة بالنسبة للتصوير الفلوري للخلايا. بعد الطلاء ، يمكن تخزين الشرائح الزجاجية المطلية بالتيتانيوم / الذهب في غرفة تفريغ جافة في درجة حرارة الغرفة لمدة شهر واحد على الأقل.
فئة < p = "jove_title" >3. طباعة الاتصال المصغر
- قم بتقطيع الشريحة المطلية بالتيتانيوم / الذهب إلى قطع أصغر ، إذا رغبت في ذلك. يوصى باستخدام شكل مربع 12 مم × 12 مم لتطبيق نموذجي (الشكل 1 ب).
- استخدم قاطع زجاج للانزلاق عبر السطح لترك مسار منبعج ، ثم أمسك الشريحة الزجاجية على كلا الجانبين وانحنى عند الانبعاج لتقسيم إلى أرباع صغيرة. تجنب لمس السطح المطلي بالذهب.
ملاحظه: لتحديد أي جانب من الزجاج هو السطح المطلي بصريا في حالة الانقلاب العرضي ، قارن انعكاس الضوء على كلا الجانبين. سيظهر السطح المغطى بالذهب انعكاسا أكثر إشراقا ، في حين أن الجانب غير المطلي سيكون له انعكاس باهت (من طبقة التيتانيوم على الجانب الآخر من الزجاج). طريقة بديلة هي مراقبة حواف الشريحة ، ويمكن تحديد جانب الطلاء من سطح القطع الرأسي.
- نظف الشرائح عن طريق نقع الإيثانول بنسبة 100٪ في طبق بتري مع وضع الجانب الذهبي لأعلى على شاكر مداري لمدة 10 دقائق على الأقل.
- نظف طوابع PDMS بالماء والصابون ثم الإيثانول بنسبة 100٪. جفف الطوابع بغاز النيتروجين.
- تحضير محلول أوكتاديكانيثيول (C18) 2 ملي مولار عن طريق إذابة 5.74 مجم من مسحوق C18 في 10 مل من الإيثانول بنسبة 100٪.
ملاحظه: ختم وتخزين محلول C18 في درجة حرارة الغرفة. تخلق أنماط الطباعة باستخدام C18 طبقة أحادية لاصقة ذاتية التجميع يتم إرفاقها بها الفبرونيكتين والخلايا بشكل تفضيلي.
- انقع طوابع PDMS في محلول C18 بحيث يكون السطح المزخرف متجها لأسفل لمدة 10 ثوان وجففها برفق بغاز النيتروجين لمدة 60 ثانية
ملاحظه: عند التجفيف ، ضع التيار بعيدا عن الختم أولا (حوالي 1 متر) حتى يتبخر معظم السائل ثم حرك التيار ببطء بالقرب من الختم تماما لتجفيف الختم تماما. هذا لتجنب تفجير محلول C18 بدلا من التجفيف على الختم.
- ضع الختم ووجهه لأسفل على الشرائح الذهبية لمدة 60 ثانية قبل إزالتها.
- لضمان الختم المناسب ، اضغط برفق على الملقط على الطوابع لنقل الأنماط بشكل صحيح. لا تضغط لأسفل بشدة ، وعادة ما يكون وزن الملقط كافيا.
ملاحظه: سيضمن الفحص البصري للختم أثناء التنصت أن الختم والشريحة الزجاجية قد اتصلت بشكل موحد.
- تحضير غرف الرطوبة.
- ماصة 1 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ في غطاء طبق بتري مقلوب ووضع قطعة من البارافيلم لتغطية السطح (مغطى ووجهه لأعلى).
- استخدم الملقط للرفع ووضع البارافيلم لضمان عدم وجود فقاعات هواء وإزالة الإيثانول الزائد إذا لزم الأمر.
- تحضير محلول 2 ملي مولار HS- (CH2) 11-EG3-OH (EG3): قم بتخفيف محلول مخزون 5 ميكرولتر في 5 مل من الإيثانول بنسبة 100٪.
ملاحظه: يمكن إغلاق محلول EG3 المخفف وتخزينه عند 4 درجات مئوية ، ويجب تخزين مخزون EG3 غير المخفف عند -20 درجة مئوية. يستخدم علاج EG3 لجعل المنطقة الزجاجية بدون C18 غير لاصقة للخلايا.
- تنزلق الماصة الدقيقة 40 ميكرولتر من EG3 لكل ربع زجاج على البارافيلم في غرفة الرطوبة، مما يترك مسافة كافية بين القطرات لحساب تباعد الشرائح الذهبية.
- استخدم الملقط لوضع شرائح ذهبية مطبوعة باللون C18 ووجهها لأسفل على القطرات وتأكد من عدم وجود فقاعات أسفل الشرائح. ادفع الشرائح معا برفق دون رفعها لتقليل التبخر.
ملاحظه: ضع إحدى الحواف من الزجاج لأسفل بالقرب من القطرة ، ثم قم بخفض الطرف الآخر من الزجاج ببطء لأسفل. في حالة وجود فقاعة ، ادفع الشريحة الذهبية دون رفعها حتى تختفي الفقاعة.
- أغلق طبق بتري بإحكام باستخدام البارافيلم واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات على الأقل < br / >
ملاحظه: إذا كانت هناك رغبة في حضانة واسعة النطاق ، فقم بإغلاق طبق بتري مرتين واتركه لمدة تصل إلى 24 ساعة.
- في خزانة السلامة الحيوية ، ضع شرائح الذهب ووجهها لأعلى في طبق بتري ، وانقعها واشطفها 3 مرات في 70٪ من الإيثانول لإزالة EG3 ، ثم اتركيها في الإيثانول لمدة 10 دقائق للتعقيم.
- استنشق الإيثانول واستبدله ب PBS معقم.
- قم بإعداد غرفة رطوبة أخرى كما هو موضح في الخطوة 3.9 ، باستخدام PBS بدلا من الإيثانول.
ملاحظه: نظرا للاختلاف في التوتر السطحي ، من الأسهل أولا إضافة 4-5 مل من PBS لوضع البارافيلم وإزالة الفقاعات ، ثم استنشاق الفائض.
- قم بإعداد محلول الفيبرونيكتين 50 ميكروغرام / مل (بروتينات أخرى ، إذا رغبت في ذلك) في PBS معقم وماصة دقيقة 50 قطرات من محلول الفيبرونيكتين لكل ربع ينزلق على البارافيلم ، مع ترك بعض المسافة بين القطرات.
ملاحظه: يسهل طلاء الفيبرونيكتين التصاق الخلايا بالأسطح المزخرفة.
- استخدم ملاقط الويفر لوضع الشرائح ووجهها لأسفل على القطرات وتأكد من عدم وجود فقاعات أسفل الشرائح. ادفع الشرائح برفق معا دون رفعها.
ملاحظه: يوصى باستخدام ملاقط زجاجية منزلقة أو ملاقط بسكويت الويفر ذات أطراف عريضة مستقيمة للتعامل مع الشرائح.
- اترك طبق بتري في خزانة السلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة.
- بعد 30 دقيقة ، ضع الشرائح الذهبية ووجهها لأعلى في PBS بعد الشطف لمدة 3 مرات.
ملاحظه: يمكن تخزين الشرائح المزخرفة ب Fibronectin في PBS عند 4 درجات مئوية لمدة شهر تقريبا.
< p class = "jove_title" >4. بذر الخلايا على شرائح منقوشة دقيقة
- قم بتسخين وسائط زراعة الخلايا والتربسين في حمام مائي 37 درجة مئوية.
ملاحظه: الوصف التالي للزراعة الفرعية مخصص لخلايا المعاهد الوطنية للصحة / 3T3. قد تختلف ظروف الثقافة حسب أنواع الخلايا.
- (اختياري) انقع الشرائح المزخرفة في وسط الاستزراع في طبق من 12 بئرا ، وقم بتسخينه حتى 37 درجة مئوية في حاضنة قبل التربسين للخلايا لتحسين ارتباط الخلايا.
- قم بتربسين الخلايا ، وتحييدها باستخدام الوسائط المحتوية على FBS ، وجهاز الطرد المركزي لأسفل عند 100 × جم لمدة 3 دقائق ، ثم أعد تعليقها عن طريق الخلط جيدا مع الوسائط الجديدة.
ملاحظه: تأكد من أن الخلايا منفصلة تماما عن بعضها البعض.
- عد الخلايا ، وخفف إلى 200,000 خلية / مل وأضف 0.5 مل من تعليق الخلية إلى كل بئر يحتوي على شريحة ذهبية واحدة.
- رج صفيحة البئر برفق عدة مرات لبذر الخلايا بشكل موحد وقم بتخزينها في حاضنة لمدة 15 دقيقة للسماح بربط الخلية.
- بعد 15 دقيقة ، تحقق من مرفق الخلية تحت المجهر. اترك وقتا إضافيا ، إذا لزم الأمر.
ملاحظه: ستنتشر الخلايا المرفقة على السطح مع خيوط مرئية أو تسطيح ولن تتحرك من السطح عند النقر على صفيحة البئر أو تحريكها برفق.
- قم بشفط الوسائط التي تحتوي على خلايا غير متصلة من كل بئر وأضف 1 مل من وسائط الاستزراع. للعلاج من تعاطي المخدرات ، استكمل كواشف إضافية لوسائط الاستزراع في هذه الخطوة.
- استزراع الخلايا في الحاضنة لمدة 24 ساعة وتحقق من التقاء لتحديد ما إذا كان التماثل قد تشكل.
ملاحظه: يوصى بالتقاء أعلى من 75٪ لمعظم أنواع الخلايا ، وقد يؤثر الإفراط في التقاء على توصيف التماثل.
5. مجموعة الصور
- إصلاح الخلايا عند التقاء.
- قم بإزالة وسائط الثقافة من لوحة البئر واشطفها مرة واحدة باستخدام PBS.
- أضف 4٪ محلول بارافورمالدهايد ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، ثم اشطفه 3 مرات باستخدام PBS.
ملاحظة: إذا كان التثبيت يغير مورفولوجيا الخلية بشكل كبير ، فمن المستحسن التصوير قبل التثبيت
- استخدم مجهر تباين الطور مع وظيفة الكاميرا ، وقم بتصوير كل حلقة على الشرائح بدقة عالية (عدسة كائن 10x كافية للتحليل).
< p class = "jove_title" >
6. توصيف تماثل الخلية (الشكل 2)
- قم بتنزيل ملفات التعليمات البرمجية MATLAB لتوصيف chirality.
- أضف مجلد التعليمات البرمجية والمجلدات الفرعية (مع صندوق أدوات الإحصائيات الدائرية بالداخل) إلى مسار MATLAB وافتح ملف "ROI_selection.m". في السطر 4 ، قم بتغيير الدليل إلى مجلد البيانات المطلوب (لمستخدمي النافذة ، قم بتبديل "/" إلى "\" في السطرين 4 و 5).
- قم بتغيير حجم الصورة في السطر 14 ، حيث يمثل الشكلان الأولان حجم الدائرة الداخلية للحلقة بينما يمثل الشكلان الآخران حجم الدائرة الخارجية.
ملاحظه: تأكد من أن أحجام جميع الصور في المجلد المراد تحليله متطابقة.
- انقر فوق الزر "تشغيل" لتنفيذ كود MATLAB "ROI_selection.m" لتحديد منطقة الاهتمام (ROI) في صور تباين الطور.
- اسحب مربع التحديد يدويا ليناسب الحلقة ، ثم انقر نقرا مزدوجا فوق الصورة لتأكيد التحديد.
- كرر هذه الخطوة لكل صورة في المجلد (ستظهر الصورة التالية تلقائيا بعد تأكيد اختيار عائد الاستثمار لصورة سابقة) ؛ سيتم إنشاء ملف ".mat" لتخزين معلومات عائد الاستثمار لكل صورة.
- افتح ملف "Analysis_batch.m" وقم بتغيير دليل المجلد بنفس الخطوة 6.2. (بالنسبة لمستخدمي النافذة ، للاستخدام لأول مرة ، قم بتبديل "/" إلى "\" في الأسطر 5 و 6 و 124 و 130)
- انقر فوق الزر "تشغيل" لتنفيذ الرمز "Analysis_batch.m" لتحديد تماثل أنماط الحلقات الخلوية المتعددة. سيتم إنشاء ملف "datatoexcel.txt" يحتوي على إحصائيات دائرية لكل حلقة بالإضافة إلى عدد الحلقات في اتجاه عقارب الساعة وغير اللولبية وعكس اتجاه عقارب الساعة.
