$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
فئة
1. عزل EV ووضع العلامات على المركبات الكهربائية المناعية الفلورية على الرقاقة
- جمع وسائط زراعة الخلايا (CCM) والمعالجة المسبقة ل CCM لعزل EV
- بذور خلايا PC3 عند التقاء 30٪ في قارورة ثقافة خلية 75 سم2. اسمح لخلايا التحكم بالنمو إلى 90٪ من التقاء (~ 48 ساعة) في الوسائط القياسية والمكملات الخاصة بخط الخلية.
ملاحظه: لمنع المكونات المحتوية على EV من التأثير على امتصاص الخلايا (أي مصل الأبقار الجنينية) ، استخدم الوسائط والمكملات الغذائية المستنفدة من الإكسوسوم.
- حصاد CCM.
- جهاز الطرد المركزي CCM عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) لحبيبات أي خلايا غير متصلة وحطام كبير يتم حصاده بالوسائط. انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي جديد.
- في الأنبوب الجديد ، قم بالطرد المركزي للطافي عند 10,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لحبيبات الحطام الأصغر والأجسام موت الخلايا المبرمج المتبقية في الوسائط. بعض المركبات الكهربائية الأكبر حجما سوف تبيل. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
- قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح حقنة غشائية محبة للماء من البولي فينيلدين فلوريد (PVDF) بحجم 0.45 ميكرومتر.
ملاحظه: إذا لم تتم معالجة CCM لعزل EV على الفور ، فقم بتخزين CCM المعالجة مسبقا عند -80 درجة مئوية حتى يتم إجراء العزل. إذا تم تجميدها ، قلل من دورات التجميد والذوبان إلى واحدة.
- عزل المركبات الكهربائية عن CCM باستخدام جهاز ميكروفلويديك قائم على الترشيح النانوي
- إذا تم تجميدها ، فقم بإذابة CCM والدوامة تماما لمدة 30 ثانية قبل الخطوة 1.2.2.
- حقن 1 مل من CCM المعالجة مسبقا (الخطوة 1.1) في غرفة العينة لجهاز الموائع الدقيقة القائم على الترشيح النانوي (انظر جدول المواد).
ملاحظه: اتبع إجراءات التشغيل القياسية لجهاز الموائع الدقيقة القائم على الترشيح النانوي.
- قم بالدوران بسرعة 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في آلة الغزل ذات الطاولة (انظر جدول المواد) لتشغيل جهاز الموائع الدقيقة.
ملاحظه: إذا ظل CCM على حجرة العينة بعد التشغيل الأولي، فقم بإجراء دورات إضافية حتى يتم إفراغ كل CCM من حجرة العينة.
- قم بإزالة السائل من غرفة النفايات عن طريق سحب العينات وكرر الخطوات 1.2.1 و 1.2.2 و 1.2.3 مرتين.
ملاحظه: في المجموع ، ستتم معالجة 3 مل من CCM لعزل المركبات الكهربائية.
قم - بحقن 1 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) في غرفة العينة لغسل المركبات الكهربائية المعزولة. قم بالدوران في آلة الغزل ذات الطاولة لتشغيل جهاز الموائع الدقيقة كما هو مذكور في الخطوة 1.2.3. حدد موقع المركبات الكهربائية النقية على غشاء الجهاز.
ملاحظه: تم تأكيد جودة المركبات الكهربائية المعزولة من جهاز الموائع الدقيقة القائم على الترشيح النانوي ، على وجه التحديد ، ومقارنتها بطريقة UC التقليدية عن طريق المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) ، والمجهر الإلكتروني الماسح (SEM) ، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ، والفحص المجهري للإضاءة الهيكلية ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي في البحث السابق.
- وضع العلامات على الفلورسنت المناعي للمركبات الكهربائية باستخدام جهاز الموائع الدقيقة القائم على الترشيح النانوي (الشكل 1)
- حدد جسما مضادا خاصا بالمركبات الكهربائية وفقا للغرض من الفحص (انظر جدول المواد).
ملاحظه: قد تتداخل بعض الأجسام المضادة مع مواقع ربط الترابط الخاصة بمسارات امتصاص EV (أي الالتقام الخلوي).
- حقن 1 ميكروغرام / مل من الجسم المضاد الخاص بالمركبات الكهربائية في فتحة الشطف الخاصة بالجهاز الذي يحتوي على 100 ميكرولتر من المركبات الكهربائية المعزولة.
- احتضن لمدة 1 ساعة في الظلام في RT على شاكر لوحة لضمان التوزيع المتساوي للجسم المضاد عبر العينة.
- نعلق شريط لاصق في فتحة الشطف. حقن 1 مل من PBS في حجرة العينة لغسل أي أجسام مضادة متبقية.
- قم بتدوير الجهاز بسرعة 3000 دورة في الدقيقة حتى تصبح غرفة العينة فارغة. قم بإزالة أي سائل من غرفة النفايات عن طريق سحب العينات. حقن 1 مل PBS في غرفة العينة.
ملاحظه: سيتم وضع المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية في غرفة الغشاء.
- ماصة المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية (الشكل 2) من غرفة الغشاء إلى أنبوب كهرماني. حجب من الضوء حتى الاستخدام.
< p class = "jove_title" >2. حضانة الخلايا باستخدام المركبات الكهربائية المصنفة فلورسنت لمقايسة امتصاص EV
- استهدف بذر الخلايا وثقافتها على الأطباق المتوافقة مع زراعة الخلايا.
- قم بزرع 1 × 104 خلايا PC3 في صفيحة microslide 8 آبار (9.4 × 10.7 مم لكل بئر) مع 0.2 مل من الوسائط أو 4 × 104 خلايا PC3 في طبق 35 مم مع 1 مل من الوسائط. ضع الخلايا في طبق متوافق مع زراعة الخلايا يتكون من غطاء رفيع (سمك: 0.18 مم).
ملاحظه: يقلل الغطاء الرقيق من التشتت السلبي للضوء.
- اسمح للخلايا بالالتصاق طوال الليل في ظروف زراعة الخلايا المثلى (37 درجة مئوية ، تركيز 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 90٪ رطوبة).
- اغسل الخلايا الملتصقة مرتين باستخدام وسائط مستنفدة من الإكسوسوم (موصوفة في الخطوة 1.1.1).
- حضانة الخلايا مع المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية.
- قم بقياس تركيز المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية (الخطوة 1.3.5) عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA ، الشكل 3). حدد التركيز الأمثل للمركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية لإضافتها إلى الخلايا المستنبتة (الخطوة 2.1.2).
قم - بتخفيف المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية بوسائط مستنفدة من الإكسوسوم لتتناسب مع التركيز المطلوب المقاس في الخطوة 2.2.1. (على سبيل المثال ، 7.80 × 109 EVs (بقيمة NTA) في 200 ميكرولتر من الوسائط المستنفدة من الإكسوزوم.)
- أضف المركبات الكهربائية المخففة (الخطوة 2.2.2) إلى الخلايا المستهدفة الملتصقة المعدة في 2.1.2. احتضان للوقت التجريبي (أي 4 أو 8 أو 12 ساعة).
- اغسل الخلايا ثلاث مرات بوسائط خالية من الإكسوسوم لإزالة أي مركبات كهربائية غير داخلية.
ملاحظه: اختياري: يمكن تثبيت الخلايا بعد الغسيل.
- قم بتسمية سيتوبلازم الخلايا الملتصقة ب 1 ميكروغرام / مل من CMTMR ((5- (و -6) - (((4-كلورو ميثيل) بنزويل أمينو) رباعي ميثيل رودامين) (انظر جدول المواد) واحتضانه في ظروف زراعة الخلايا المثلى (37 درجة مئوية ، تركيز 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 90٪ رطوبة).
ملاحظه: يجب أن تتألق أصباغ منطقة الخلية بشكل منفصل عن المركبات الكهربائية المصنفة للمساعدة في تحديد الموقع المكاني (الداخلي أو السطحي) للمركبات الكهربائية المسننة أثناء مقايسة امتصاص المركبات الكهربائية.
- اغسل الخلايا الملصقة مرتين باستخدام وسائط مستنفدة للإكسوسوم لإزالة الصبغة المتبقية. أضف وسائط جديدة مستنفدة من الإكسوسوم إلى الخلايا استعدادا للتصوير متحد البؤر للخلايا الحية.
< p class = "jove_title" >3. الفحص المجهري متحد البؤر
- لإجراء تصوير الخلايا الحية ، استخدم حاضنة على المسرح للحفاظ على ظروف زراعة الخلايا المثلى (37 درجة مئوية ، تركيز 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 90٪ رطوبة).
- ضع الخلايا المحضرة في الحاضنة على المسرح.
- قم بتعيين معلمات التصوير بناء على عينات التحكم.
ملاحظه: تشمل عينات التحكم المقترحة: المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية فقط ، والخلايا ذات العلامات الفلورية ، والمركبات الكهربائية غير المسماة ، والخلايا غير المسماة.
- تحديد عمق الخلايا المستهدفة ونطاق حجم التراص في الاتجاه z للحصول على صور 3D متحد البؤر.
ملاحظه: سمك المكدس Z هو 1 ميكرومتر. استمر الحصول على صورة ثلاثية الأبعاد متحد البؤر لمدة دقيقتين و 34 ثانية (استغرق كل الحصول على صورة على المستوى Z حوالي 8 ثوان ؛ ما مجموعه عشرين صورة Z-stack).
- اضبط الحصول على الصور على صور متعددة مكدسة على شكل حرف z لكل من الصبغة الخاصة بالخلية (أي الحمراء) والصبغة الخاصة بالمركبات الكهربائية (أي الأخضر) في وقت واحد (الشكل 4 والشكل 5 أ).
< p class = "jove_title" >4. معالجة الصور
- استخدم برنامج معالجة الصور التلقائي لتحليل الصور البؤرية الخام المكدسة على شكل z وتحديد امتصاص الخلايا للمركبات الكهربائية (انظر جدول المواد).
- قم بتعيين معلمات العتبة لإشارة الفلورسنت للخلايا والأصباغ الخاصة بالمركبات الكهربائية. قم ببناء الأسطح الافتراضية للخلايا (الشكل 5 أ ، ب).
- لإنشاء الأسطح الافتراضية للخلايا، انقر فوق الزر إضافة أسطح جديدة.
- حدد أقصر حساب مسافة ك "إعدادات الخوارزمية" لاستخدام الخوارزمية التي يوفرها البرنامج ، ثم انقر فوق التالي: قناة المصدر.
- حدد القناة 2 - CMTMR ك "القناة المصدر" في هذه التجربة.
- حدد أملس وضع القيمة المناسبة في "تفاصيل الأسطح" لتنعيم السطح.
ملاحظة: 0.57 ميكرومتر في هذه التجربة حيث يمثل بكسل واحد 0.57 ميكرومتر في بيانات التصوير الأولية.
- حدد الكثافة المطلقة ك "العتبة".
- لتعيين عتبة الصورة الفلورية تلقائيا بواسطة الخوارزمية المتوفرة، انقر فوق Threshold (Absolute Intensity): يتم تعيين القيمة تلقائيا.
- حدد تمكين ك "تقسيم كائنات اللمس (نمو المنطقة)" وضع قيمة الحجم المقدر للخلية في "قطر نقاط البذرة"، 10.0 ميكرومتر في هذه التجربة. ثم انقر فوق التالي: تصفية النقاط الأولية.
- لتكوين أسطح الخلايا الظاهرية، انقر فوق الزر + إضافة، ثم حدد الجودة ك "نوع الفلتر". حدد القيمة المناسبة (210 في هذه التجربة) للحد الأدنى عن طريق فحص مرئي والقيمة القصوى (1485) للحد الأعلى، ثم انقر فوق الزر إنهاء.
ملاحظه: يعني الفحص البصري أنه يمكن للباحث تمييز المنطقة الخلوية عن صورة الفلورسنت الخام.
- بعد ذلك ، لبناء النقاط الافتراضية للمركبات الكهربائية ، انقر فوق الزر إضافة نقاط جديدة.
- حدد أحجام موضعية مختلفة (منطقة متزايدة) وحساب أقصر مسافة ك "إعدادات الخوارزمية"، ثم انقر على التالي: القناة المصدر.
- حدد القناة 1 - Alexa Fluor 488 ك "قناة المصدر" في هذه التجربة.
- ضع القيمة المناسبة في "قطر XY المقدر" للكشف عن البقعة ، 1 ميكرومتر في هذه التجربة. ثم انقر فوق التالي: تصفية المواقع.
- لتكوين نقاط EV الظاهرية، انقر فوق الزر + إضافة، وحدد الجودة ك "نوع التصفية"، وقم بتعيين "الحد الأدنى" من خلال الفحص البصري، 100 في هذه التجربة. ثم انقر فوق الزر التالي: نوع المنطقة الموضعية.
- حدد الكثافة المطلقة ك "نوع المناطق الموضعية"، ثم انقر على التالي: مناطق بقعة.
- إلى العتبة ، منطقة نقاط EV ، ضع القيمة المناسبة في "عتبة المنطقة" عن طريق الفحص البصري ، 100 ك "عتبة المنطقة" في هذه التجربة.
ملاحظه: يعني الفحص البصري أنه يمكن للباحث تمييز منطقة المركبات الكهربائية عن صورة الفلورسنت الخام.
- حدد وحدة تخزين المنطقة ك "القطر من"، ثم انقر على إنهاء.
- استخدم الخوارزميات المتوفرة من البرنامج لتقسيم البقع المجمعة داخل السطح المبني في الخطوة 4.2 (الشكل 5C ، i-iv).
- انقر فوق النقاط المضمنة، ثم انتقل إلى الفلاتر.
- انقر فوق الزر + إضافة، ثم حدد أقصر مسافة إلى Surfaces Surfaces Surfaces = Surface 1 كنوع مرشح، ثم انقر فوق تكرار التحديد إلى زر Spots الجديد. الحد الأدنى (-7.0 في هذه التجربة) للحد الأدنى والقيمة المناسبة (-0.5) للحد الأعلى.
ملاحظه: قم بتعيين الحد الأعلى بنصف القطر المقدر للبقاط. في هذه التجربة ، تم ضبط القطر المقدر للبقع ، أي نقاط EV ، على 1 ميكرومتر في الخطوة 4.2.11. وبالتالي ، يمكن أن يكون الحد الأعلى 0.5.
- العد التلقائي للمركبات الكهربائية داخل الخلايا
ملاحظه: سيقوم البرنامج تلقائيا بحساب عدد المركبات الكهربائية داخل الخلايا ، مما يشير إلى العدد الذي تستوعبه الخلايا المستهدفة.
- انقر فوق تحديد البقع المبنية 1 [أقصر مسافة إلى الأسطح = الأسطح 1 بين -7.00 و -0.500].
- انتقل إلى الإحصائيات، وقم بتصدير القيمة من "إجمالي عدد الأماكن"
ملاحظه: ستقوم الخوارزميات المتوفرة بالبرنامج تلقائيا بحساب عدد الخلايا وحجمها.
- حدد عائد امتصاص المركبات الكهربائية لكل فترة حضانة بناء على القيم المحسوبة أعلاه (الشكل 6).
- للحصول على عدد الخلايا ، انقر فوق الأسطح المبنية 1 ، ثم انتقل إلى الإحصائيات ، وقم بتصدير قيمة "إجمالي عدد الأسطح" من بشكل عام.
- انتقل إلى مفصل إلى إحصائيات لتصدير المجلد من مفصل.
