مقالة منهجية

فحص التقاط الجسيمات الشبيهة بالفيروسات: طريقة لعزل VLPs التي تعرض المستضد من عينة باستخدام حبات مغناطيسية مترافقة بالأجسام المضادة المعادلة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Rosengarten، J. F.، et al. الكشف عن الحلقات الحساسة للتحييد في المستضدات المعروضة على اللقاحات القائمة على الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLP) باستخدام مقايسة الالتقاط. J. Vis. Exp. (2022).

في هذا الفيديو ، نوضح مقايسة الترسيب المناعي ، تسمى مقايسة التقاط VLP ، لعزل الجسيمات الشبيهة بالفيروسات التي تعرض المستضد ، أو VLPs ، من العينة. يرتبط المستضد بأجسام مضادة محددة مرتبطة بالخرز المغناطيسي ، مما يشكل مركبا ثابتا للأجسام المضادة المستضد الذي يتم فصله لاحقا وتخزينه لمزيد من التحليل.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تحضير العينة

  1. قم بزرع خطوط الخلايا المعلقة لمنتج VLP المشتقة من خلايا 293-F التي تعبر عن الجينات الهيكلية لفيروس نقص المناعة البشرية بمفردها أو بالتنسيق مع env بكثافة خلوية منخفضة تبلغ 0.5 × 106 خلايا لكل مل في وسط التعبير 293-F.
  2. دعهم يتوسعون لمدة 3-4 أيام عند 37 درجة مئوية و 8٪ ثاني أكسيد الكربون2 في دوران حاضنة شاكر بمدار 5 سم و 135 طلقة في الدقيقة (دورة في الدقيقة).
  3. قم بتكبيل الخلايا المنتجة عن طريق الطرد المركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق. قم بتصفية المادة الطافية المصفاة لإزالة الخلايا المتبقية وبقايا الخلايا باستخدام مرشحات الحقنة الغشائية بفلوريد البولي فينيلدين (PVDF) 0.45 ميكرومتر للحصول على طافي لزراعة الخلايا (CFSN).
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين CFSN طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  4. إما أن تستخدم CFSN مباشرة للتجربة أو بيليه VLPs من 35 مل من CFSN باستخدام الطرد المركزي الفائق (112,700 × جم ، 4 درجات مئوية ، 1.5 ساعة).
  5. عند الطرد المركزي الفائق ، تخلص من المادة الطافية كريات VLP في 200 ميكرولتر من محلول تريهالوز بنسبة 15٪ (وزن / حجم) لكل أنبوب طرد مركزي.
    ملاحظة: غالبا ما تكون حبيبات VLP غير مرئية للعين المجردة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين VLPs عند -80 درجة مئوية.
  6. قبل اختبار التقاط VLP ، حدد تركيزات البروتين الأساسي الفيروسي في العينات المحتوية على VLP باستخدام ELISA. هذه الخطوة مهمة لتوحيد إدخال مقايسة الالتقاط.

2. مقايسة التقاط VLP

ملاحظة: يتم تصوير نظرة عامة على سير العمل في الشكل 1.

  1. قم بتعليق الخرزات المغناطيسية إما عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل أو الخلط على دوار عند 50 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق على الأقل.
  2. في هذه الأثناء ، قم بإعداد محلول الجسم المضاد الذي يحتوي على bNAbs. استخدم 10 ميكروغرام من كل bNAb في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط الأجسام المضادة والغسيل (انظر جدول المواد) لكل تفاعل.
    ملاحظة: قد تختلف كميات الأجسام المضادة اعتمادا على تقارب bNAb وكثافة زخرفة المستضد على VLPs المستخدمة.
  3. استخدم 50 ميكرولتر من محلول الخرزة المغناطيسية (انظر جدول المواد) لكل تفاعل وانقل الخرزات إلى أنبوب تفاعل 1.5 مل. ضع الأنابيب على رف الفصل المغناطيسي.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مغناطيس واحد قوي لكل أنبوب لفصل الخرز عن المادة الطافية.
  4. انتظر بضع دقائق حتى تتجمع الخرزات عند جدار الأنبوب للتأكد من جمع جميع الخرز. قم بإزالة المادة الطافية.
  5. قم بإزالة المغناطيس الخرزات في 200 ميكرولتر من محلول bNAb المحضر في الخطوة 2.2. احتضن لمدة 30 دقيقة إلى 3 ساعات والخلط على دوار عند 50 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. ضع أنابيب التفاعل في رف الفصل المغناطيسي مرة أخرى ، وانتظر وقم بإزالة المادة الطافية.
  7. قم بإزالة الأنابيب من المغناطيس وغسل الخرزات عن طريق تعليق 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة ملزمة وغسيلها.
  8. كرر الخطوة 2.4. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من مخزن الغسيل.
  9. أضف العينات إلى bNAbs.
    المرتبط بالخرز. ملاحظة: يجب أن يكون مدخلات VLP لمقايسة الالتقاط باستخدام الجسيمات المشتقة من فيروس نقص المناعة البشرية 15 نانوغرام على الأقل من البروتين الأساسي الفيروسي لكل تفاعل. قد تختلف كميات VLP اعتمادا على تقارب bNAb ، وكثافة زخرفة المستضد على VLPs المستخدمة.
  10. إذا كان حجم العينة المضاف في الخطوة 2.9 أقل من 1 مل، فقم بإضافة PBS لضبط حجم العينة إلى 1 مل. الخرزات برفق عن طريق سحب العينات.
  11. احتضان العينات والخرز لمدة 2.5 ساعة على دوار في درجة حرارة الغرفة. تأكد من بقاء الخرزات معلقة وخلط المحلول جيدا أثناء الحضانة.
  12. ضع الأنابيب على المغناطيس وقم بإزالة المادة الطافية.
  13. اغسل الخرزات المغناطيسية عن طريق تعليقها في 200 ميكرولتر من عازلة الغسيل (انظر جدول المواد). كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات.
  14. قم بتعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من عازلة الغسيل وانقل التعليق إلى أنبوب تفاعل نظيف (مقاوم للحرارة).
  15. ضع الأنبوب على رف الفصل المغناطيسي (انظر جدول المواد) وقم بإزالة المادة الطافية تماما.
  16. قم بإعداد عينات SDS-PAGE مشوهة باتباع الخطوات 2.16.1-2.16.2 أو عينات غير مشوهة عن طريق مسح VLPs من الخرزات المغناطيسية باتباع الخطوات 2.16.3-2.16.5.
    1. لتحضير عينات SDS-PAGE مشوهة ، قم بتعليق الخرزات في 20-80 ميكرولتر من محلول Laemmli (0.8 ميكرولتر من المخزن المؤقت Laemmli لكل 1 نانوغرام من مدخلات فحص p55 Gag) واحتضانها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. تابع مباشرة مع SDS-PAGE أو قم بتخزين العينات عند -20 درجة مئوية
      تحذير: يحتوي Laemmli Buffer على 2-mercaptoethanol وكبريتات دوديسيل الصوديوم. ارتد قفازات واقية وحماية للعين. تجنب ملامسة الجلد والعينين والملابس. لا تستنشق الأبخرة. اعمل في مكان جيد التهوية ، على سبيل المثال ، غطاء الدخان.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
    3. بدلا من ذلك ، قم بإجراء خطوة شطف غير متغيرة للحصول على VLPs مع بنية بروتين أصلية محفوظة.
    4. أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف (يتم توفيره بشكل متكرر مع الخرز) إلى الخرز المغناطيسي واحتضانه لمدة 2-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. قم بإزالة الخرز وانقل الشفاط إلى أنبوب نظيف. استخدم المصف للمقايسات اللاحقة أو قم بتخزينه عند 4 درجات مئوية
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي للخطوات الرئيسية لمقايسة التقاط VLP باستخدام المواد الطاحية الخالية من الخلايا. (1) يبدأ مقايسة التقاط VLP بربط فيروس نقص المناعة البشرية -1 bNAbs بالخرز المغناطيسي المقترن بالبروتين G. وفي الوقت نفسه ، يتم تحضير محلول VLP بتركيز p55 محدد. يتكون المادة الطافية للثقافة الخالية من الخلايا من خليط من p55 Gag VLPs وبروتينات الخلية المضيفة والأحماض النووية. (2<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 مل أنابيب تفاعلEppendorf
10x PBSgibco70011044
الأجسام المضادة (bnAbs)Polymun Scientic
Dynabeads Protein G
Immunoprecipitation Kit		invitrogen (Thermo Fisher Scientific)10007Dيتضمن المخازن المؤقتة وحلول الغسيل
خلاياFreeStyle 293-Finvitrogen (Thermo Fisher Scientific)R790-07
FreeStyle 293 Expression Mediuminvitrogen (Thermo Fisher Scientific)12338026 رف
الفصل المغناطيسيNew England BiolabsS1509Sل 12 × 1.5 مل أو 6 × 1.5 مل أنابيب
Optima XE-90 أجهزة الطرد المركزي الفائقةبيكمان كولتر
فلوريد البولي فينيلدين (PVDF)
مرشحات الحقن ، 0.45 ومايكرو. م		كارل روثKC89.1
غشاء نقل PVDF ، 0.45 & مايكرو ؛ مكارل روثT830.1
QuickTiter HIV p24 ELISACell BiolabsVPK-108-H
الدوارHeidolphREAX2
SW28 الدوارBeckman Coulter
ThermomixerCel Mediaالأساسي
تريهالوز ثنائي هيدراتكارل روث8897.2
الطرد المركزي فائقة الوضوحبيكمان كولتر344058
أنابيب

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SDS

مقالات ذات صلة