مقايسة المعاوقة القائمة على المصفوفة ثلاثية الغرف: تقنية تحليل في الوقت الفعلي لتقييم الإمكانات الغازية للخلايا السرطانية عن طريق قياس المعاوقة الكهربائية

Abstract

المصدر: Sharif، G.M. et al.، الكشف في الوقت الفعلي والتقاطها من مجموعات الخلايا الغازية الفرعية من الثقافات المشتركة. J. Vis. Exp. (2022).

يصف هذا الفيديو اختبار الغزو باستخدام مصفوفة من ثلاث غرف تعتمد على المعاوقة الكهربائية. تقيس هذه التقنية الإمكانات الغازية للخلايا السرطانية تحت تأثير العوامل القابلة للذوبان التي تفرزها الخلايا اللحمية المقيمة في البيئات المكروية للورم.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. تصميم غرفة جديدة (الشكل 1)

1. افتح لوحة محلل خلية جديدة مزدوجة الغرفة. ضع الحجرة العلوية جانبا بأقطاب كهربائية.
2. باستخدام آلة الطحن ، احلق 2 مم من الآبار السفلية على شكل حرف U للوحة محلل الخلية.
3. قم بتوصيل غشاء بولي إيثر سلفون (PES) مقاس 2 سم × 7 سم بحجم مسام 0.2 ميكرومتر بقاع الآبار المحلوقة باستخدام مادة لاصقة منسقة بالأشعة فوق البنفسجية. اترك 30 دقيقة من وقت المعالجة للتأكد من أن الغراء قد تم علاجه تماما وخامله.
4. باستخدام آلة الطحن ، قم بقص شقين طوليين (1.5 مم × 5.6 مم) على طول الجانبين لالتقاط حواف الغرفة الثالثة المصنعة حديثا.
5. باستخدام آلة الطحن ، قم بإنشاء غرفة ثالثة من البولي كربونات تكرر الأبعاد الكلية للوحة محلل الخلية ؛ 72 مم × 18 مم (جدول المواد).
6. قم بإنشاء آبار بعمق 4.8 مم وقطرها 4.75 مم لتكرار التصميم المكون من 16 بئرا للوحة محلل الخلية. هذا يسمح بحجم 90 ميكرولتر لكل بئر.
7. على الجانبين ، قم بإنشاء حواف مثلثة بحيث يتم قفل الغرفة في الشقوق الأصلية التي تم إنشاؤها في الخطوة 1.4. الجزء الأفقي من المثلث 1.5 مم ، والرأسي 1.4 مم ، والوتر 2.052 مم.
8. قم بإنشاء مقبض على الجانب القصير بقطر 50.8 مم وارتفاع 1.397 مم ليناسب شق اللوحة الأصلية (الشكل 1 ، الوسط).
9. استخدم غسالة مطاطية بسمك 0.9 مم لكل بئر لتوفير ملاءمة محكمة الإغلاق.

< p class = "jove_title" >2. زراعة الخلايا (MDA-MB-231 ، DCIS ، DCIS-Δ4 ، J2-الخلايا الليفية)

1. اغسل مزارع الخلايا الملتصقة (~ 70٪ التقاء) بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS).
2. أضف محلول التربسين EDTA بنسبة 0.05٪ لرفع الخلايا.
3. قم بتحييد محلول التربسين باستخدام وسائط زراعة الخلايا التي تحتوي على مصل وعد الخلايا باستخدام كمية من معلق الخلية.
   ملاحظه: يمكن العثور على وسائط زراعة الخلايا المحددة في الجدول 1.

فئة

3. تفكك الطعم الغريب المشتق من المريض

1. قطع قطعة ورم جديدة (1 سم²) إلى هريسة ناعمة باستخدام مشرط معقم.
2. ضعها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع 20 مل من وسائط DMEM F12 مكملة ب 3 ملغم/مل من التربسين و2 ملغم/مل من الكولاجيناز.
3. احتضن في شاكر حراري (150 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
4. قم بتدوير الأنبوب عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ؛ قم بإزالة المادة الطافية.
5. أضف 20 ميكرولتر من DMEM F12 + 2٪ FBS لغسل الخلايا ؛ قم بالدوران عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية. كرر الغسيل مرتين أخريين.
6. قم بإعادة التعليق في 1 مل من وسائط PDX (الجدول 1) لحساب الخلايا.

فئة

4. استخراج خلايا نخاع العظم

1. اغسل مرشح تجميع نخاع العظم (BM) ب 25 مل من 1x PBS.
   ملاحظه: في هذه الدراسة ، تمت إضافة PBS إلى مرشح تجميع BM المستخدم من المستشفى لجمع BM المتبقي في الفلتر.
2. أضف BM المتدفق ببطء إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع 25 مل من وسط تدرج الكثافة ، مع الحرص على إبقاء الطبقات منفصلة قدر الإمكان.
3. تدور عند 800 × جم لمدة 20 دقيقة عند 18 درجة مئوية.
قم
4. بسحب الطبقات العليا بعد الطرد المركزي (الدهون / البلازما) وانقل 5 مل من الطبقة البيضاء فوق وسط تدرج الكثافة الذي يحتوي على خلايا BM إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
   ملاحظه: بدلا من ذلك، اغمس ماصة سعة 5 مل في الطبقة العليا حتى تلامس الطبقة الوسطى (BM)، وأخرج الماصة الطبقة الوسطى ببطء شديد دون تحريك الماصة.
5. املأ الأنبوب المخروطي سعة 15 مل ب 1x PBS (~ 10 مل) وقم بالدوران عند 300 × جم لمدة 15 دقيقة.
6. قم بإزالة المادة الطافية ؛ الحبيبات البيضاء المتبقية هي BM.
7. إذا لوحظت خلايا الدم الحمراء في الحبيبات ، أضف 5 مل من محلول تحلل كرات الدم الحمراء (جدول المواد) واتركه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بالدوران على 300 × جم لمدة 5 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية.
8. أضف 10 مل من 1x PBS لغسل الخلايا ، وقم بالدوران عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية. كرر تحلل كرات الدم الحمراء (الخطوة 4.7) حتى تصبح الحبيبات بيضاء.

< p class = "jove_title" >5. بذر الخلايا وتجميعها

1. ضع جميع الغرف الثلاث المعقمة في غطاء مزرعة الأنسجة.
2. حدد موقع المقبض على الجانب القصير من الغرفة السفلية. قم بتوجيه الغرفة السفلية بحيث يكون المقبض مواجها للمجري.
3. أضف 30.000-50.000 خلية في 90 ميكرولتر من الوسائط إلى كل بئر في الغرفة السفلية. تجنب تكوين الفقاعات. هذه هي الخلايا اللحمية التي ستوفر عوامل مفرزة ولكن لن يتم اكتشافها بواسطة أقطاب الغرفة العلوية.
4. استخدم وسائط مكملة بمصل الأبقار بنسبة 5٪ في بئرين من الغرفة السفلية كعنصر تحكم إيجابي في حركة الخلايا. استخدم وسائط مكملة بالمصل بنسبة 0٪ كعنصر تحكم سلبي.
5. دع الغرفة السفلية مع الخلايا تجلس لمدة 10-15 دقيقة في غطاء المحرك لتستقر.
   ملاحظه: يوصى بهذه الخطوة إذا كانت الخلايا ملتصقة أو تنمو في حالة تعليق.
6. قم بتدوير الغرفة السفلية عند 90 درجة وضع الغرفة الوسطى في الأعلى بحيث ينزلق المقبض الموجود على الغرفة السفلية إلى الشق الموجود في الغرفة الوسطى.
   ملاحظه: يقع المقبض الموجود في الغرفة السفلية والنقطة الزرقاء في الغرفة الوسطى على طرفي نقيض من التجميع.
7. ادفع عموديا لأسفل حتى يسمع صوت نقرة من كل جانب من الجانبين الطويلين للتجميع.
8. أضف 160 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل إلى جميع آبار الغرفة الوسطى.
9. تأكد من ظهور الغضروف المفصلي على شكل قبة بعد ملء الآبار؛ وإلا، اضبط الحجم النهائي بناء على معايرة الماصة. تجنب تكوين الفقاعات.
10. ضع الحجرة العلوية بحيث تكون الأقطاب الكهربائية متجهة لأسفل على الغرفة الوسطى ، مع التأكد من محاذاة النقاط الزرقاء على الغرفتين الوسطى والعليا.
11. ادفع عموديا لأسفل حتى يسمع صوت نقرة من كل جانب من الجانبين الطويلين للتجميع.
12. أضف 25-50 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل إلى الغرفة العلوية.
13. قم بتركيب التجميع على محلل الخلايا ثنائي الغرض في حاضنة زراعة الأنسجة وانتظر لمدة 30 دقيقة قبل قياس الخلفية.
    ملاحظه: هذه المرة ضرورية لموازنة المصفوفة ويمكن استخدامها لإعداد خطوط الخلايا لإضافتها إلى الغرفة العلوية.
14. قم بقياس الخلفية (انظر القسم 6) وضع التجميع مرة أخرى في غطاء مزرعة الأنسجة.
15. أضف 30,000-50,000 خلية في 100 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل إلى كل بئر في الغرفة العلوية. هذه هي الخلايا التي سيكتشفها القطب بمجرد أن ينتقل بنجاح عبر الغشاء
    ملاحظه: لتحقيق أقصى قدر من الاستجابة ، يوصى بزراعة الخلايا في وسط خال من المصل أو منخفض المصل لمدة 6-18 ساعة قبل إجراء الفحص.
16. دع المجموعة تقف في غطاء المحرك لمدة 30 دقيقة قبل تركيبها على محلل الخلية ثنائي الغرض لقياس المعاوقة.

< p class = "jove_title" >6. قياس الخلفية والمعاوقة

1. ضع المصفوفة في مهد أداة محلل الخلايا ثنائية الغرض.
2. افتح برنامج محلل الخلايا وحدد المهد المراد استخدامه.
3. انقر فوق علامة التبويب رسالة وتأكد من أنها تقول الاتصالات موافق للتأكد من أن المصفوفة في وضع جيد في المهد وأن الأقطاب الكهربائية محاذاة جيدا مع المستشعرات.
4. انقر فوق علامة التبويب ملاحظات التجربة واملأ أكبر قدر ممكن من المعلومات حول التجربة.
5. انقر فوق علامة التبويب تخطيط واملأ وصف تخطيط المصفوفة.
6. انقر فوق علامة التبويب "الجدول الزمني" وأضف خطوتين من قائمة الخطوات ؛ خطوة خلفية (مسح واحد) وخطوة اختبار مع 100 عملية مسح كل 15 دقيقة ، بإجمالي 25 ساعة.
7. بعد أن تكون المصفوفة في حاضنة محلل الخلايا ثنائية الغرض لمدة 30 دقيقة ، انقر فوق الزر "تشغيل" لبدء قياس الخلفية. ستظهر نافذة تطلب اختيار المجلد لحفظ البيانات.
8. بعد الانتهاء من قياس الخلفية ، قم بإزالة المصفوفة من المهد وضعها مرة أخرى في غطاء مزرعة الخلية.
9. أضف الخلايا إلى الغرفة العلوية كما هو موضح في الخطوة 5.13 ، واحتفظ بالتجميع في غطاء مزرعة الأنسجة لمدة 30 دقيقة حتى تستقر الخلايا.
10. ضع الصفيف مرة أخرى في محلل الخلية ثنائي الغرض وتحقق من علامة التبويب رسالة لرسالة الاتصالات موافق.
11. انقر فوق الزر "تشغيل" لبدء قياس المعاوقة.
12. انقر فوق علامة التبويب رسم لمراقبة تقدم الإشارة.
13. إذا تم الوصول إلى نقطة النهاية قبل الساعة 25 ، فانقر فوق خطوة الإجهاض من القائمة المنسدلة تنفيذ.
14. لتصدير البيانات، انقر بزر الماوس الأيمن على الرسم البياني، واختر نسخ بتنسيق القائمة، ثم الصق البيانات في جدول بيانات.
    ملاحظه: يمكن تصدير البيانات كفهرس خلية أو فهرس خلية دلتا. يمكن أيضا اختيار معلومات الرسم البياني و / أو التخطيط للتصدير.

< p class = "jove_content" >الجدول 1: تكوين وسائط زراعة الخلايا. يسرد الجدول تركيبات وسائط MDA-MD-231 ، ووسائط الخلايا الليفية J2 ، ووسائط DCIS ، ووسائط PDX.

وسائط المكونات التركيز / النسبة وسائط MDA-MD-231 DMEM مصل الأبقار الجنينية (FBS) 10٪ J2 Fibroblasts الوسائط DMEM مصل الأبقار الجنينية (FBS) 10٪ وسائط DCIS DMEM F12 مصل الحصان (HS) 5٪ عامل نمو البشرة (EGF) 20 نانوغرام / مل إنسولين 10 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون 0.5 ميكروغرام / مل توكسين الكوليرا 100 نانوغرام / مل وسائط PDX DMEM F12 مصل الأبقار الجنينية (FBS) 2٪ هيبس 1 م ترانسفيرين الأنسولين السيلينيوم إيثانولامين (ITS) 10 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون 0.5 ميكروغرام / مل ألبومين مصل الأبقار (BSA) 1 ملغ/مل

Results

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: صور غرف المصفوفة والتعديلات.

< p class = "jove_content" > (A) الغرف الثلاث المستخدمة لبناء المصفوفة. لم يتم إجراء أي تعديل على الغرفة العلوية التي تؤوي الأقطاب الكهربائية. (ب) من آبار الغرفة الوسطى ، تم حلق ارتفاع 2 مم وتثبيت غشاء على القاع المفتوح ؛ تمت إضافة شقوق طولية (1.5 مم × 5.6 مم) إلى كل جانب. (ج) الغرفة السفلية ...

Materials