مقايسة نشاط سينسيز السترات: اختبار لوني لقياس نشاط سينسيز سترات الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة الأنسجة المتجانسة

الملخص

المصدر: Wei ، P. ، et al. ، اختبار لوني لنشاط سينسيز السترات في ذبابة الفاكهة السوداء. J. Vis. Exp. (2020)

يصف هذا الفيديو مقايسة لونية لقياس مقايسة نشاط سينسيز سترات الميتوكوندريا الموجودة في تجانس الأنسجة ذبابة الفاكهة.

البروتوكول

p class = "jove_title" >1. مقايسة نشاط سينسيز سترات السترات الملونة ل D. melanogaster

1. اجمع عشرة ذباب بالغ لكل عينة. اجمع عينات ثلاث نسخ على الأقل لكل نمط وراثي.
2. قم بإعداد 500 ميكرولتر من محلول استخلاص الجليد البارد الذي يحتوي على 20 ملي مولار من HEPES (الرقم الهيدروجيني = 7.2) و 1 ملي مولار EDTA و 0.1٪ تريتون X-100 في أنبوب اختبار سعة 1.5 مل لكل عينة.
3. تخدير الذباب البالغ بثاني أكسيد الكربون₂ على وسادة تخدير وعزل الأنسجة المرغوبة. لعزل صدر الذبابة البالغة ، على سبيل المثال ، قم بإصلاح الصدر الذبابة بواسطة زوج من الملقط ، ثم عزل بطن الذبابة عن طريق القطع على طول حدود الصدر والبطن باستخدام مقص. اجمع الصدر الذبابي لمقايسة نشاط سينسيز سترات العضلات.
   ملاحظه: حدد الوزن الجديد للأنسجة في هذه الخطوة إذا كنت تستخدمه لتطبيع نشاط سينسيز السترات.
4. انقل 10 قفص صدر ذبابة بالغ إلى 100 ميكرولتر من مخزن الاستخراج المثلج على الفور وتجانسه باستخدام مدقة على الجليد. للحفاظ على العينات باردة ، قم بتجانس العينات لمدة 5-10 ثوان على الجليد ، ثم اجعل العينات تجلس على الجليد لمدة 5 ثوان ، وكرر ذلك حتى يتم تجانس جميع الأنسجة الموجودة في الأنبوب تماما.
   ملاحظه: قم بلصق الأنبوب ، وتحقق من المتجانسات للتأكد من عدم وجود جلطات في المتجانسات وأن الأنسجة الموجودة في الأنبوب متجانسة تماما. يجب إجراء جميع علاجات العينات على الثلج.
5. خذ 10 ميكرولتر من كل عينة متجانسة في أنبوب جديد لقياس محتوى البروتين. احتفظ بالعينات لقياس البروتين على الجليد.
   ملاحظه: يمكن تجميد عينات البروتين وتخزينها عند -80 درجة مئوية لتحليلها لاحقا. تعمل تركيزات البروتين كمعلمة داخلية لتطبيع أنشطة سينسيز السترات.
6. أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لاستخراج الثلج البارد إلى كل عينة متبقية ليصبح الحجم الإجمالي 500 ميكرولتر. لكل تفاعل ، أضف 1 ميكرولتر من محللة الخلية المخففة إلى 150 ميكرولتر من محلول التفاعل المحضر حديثا (20 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) ، 0.1 ملي مولار DTNB ، 0.3 ملي مولار أسيتيل CoA ، 1 ملي مولار حمض الأكسالو أسيتيك). تخلط جيدا وعلى الفور عن طريق سحب العينة برفق ، وتجنب تكون الفقاعات. قم بقياس الامتصاص عند 412 نانومتر كل 10-30 ثانية لمدة 4 دقائق عند 25 درجة مئوية باستخدام قارئ لوحة قادر على قياس الامتصاص عند 412 نانومتر على فترات لا تقل عن 10 ثانية < / > ملاحظه: قم بتغيير الطرف قبل سحب كاشف مختلف وتجنب تكوين فقاعات في الآبار. قد يتسبب الخلط غير الكامل للكواشف في حدوث اختلافات في القياسات. يجب إجراء مقايسة نشاط سينسيز السترات في درجة حرارة الغرفة فور جمع العينات ، حيث يتم استخدام هذا الاختبار لتحديد كتلة الميتوكوندريا السليمة. يجب تحضير المخزن المؤقت للتفاعل مباشرة قبل الاستخدام ويجب عدم تخزينه.
7. ارسم البيانات على أنها امتصاص الكثافة الضوئية (OD) (ABS) (المحور Y) مقابل الوقت (بالدقائق) (المحور X). ثم احسب الميل للجزء الخطي من المنحنى ، حيث يكون معدل التفاعل
   
   اقسم القيمة على تركيز بروتين العينة لتطبيع نشاط سينسيز السترات. يتم حساب نشاط سينسيز السترات على النحو التالي
   
   ملاحظه: يمكن قياس تركيز البروتين العينة بواسطة مجموعة فحص تركيز البروتين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2- [4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1- بيبيرازينيل] حمض الإيثان سلفونيك (HEPES) سيجما ألدريتش V900477 2-أمينو-2- (هيدروكسي ميثيل) -1،3- البروبانديول (قاعدة تريزاما) سيجما ألدريتش V900483 أسيتيل CoA سيجما ألدريتش أ 2181 حمض ديثيو بيس نيتروبنزويك (DTNB) سيجما ألدريتش د8130 حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) سيجما ألدريتش V900106 أوكسالو أسيتات سيجما ألدريتش O4126 مدقة بيليه سانجون F619072 محرك مدقة بيليه تيانجين OSE-Y10 قارئ اللوحة بيوتك ايون مجموعة فحص البروتين BCA بيوتيم P0010S مقص WPI 14124 تريتون X-100 سانجون A110694-0100