فحص حماية الإنزيم القائم على الليزوستافين: طريقة في المختبر لتحديد الحمل المكورات العنقودية الذهبية داخل الخلايا عن طريق القتل الانتقائي بوساطة الإنزيم للبكتيريا خارج الخلية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Rigaill، J. et al. محسن لفحص حماية الإنزيم لدراسة استيعاب المكورات العنقودية الذهبية والفعالية داخل الخلايا للمركبات المضادة للميكروبات. J. Vis. Exp. (2021).

في هذا الفيديو ، نوضح مقايسة حماية إنزيم في المختبر القائم على اللايزوستافين لتحديد استيعاب المكورات العنقودية الذهبية في خلايا A549. يساعد الاختبار في الدراسات النوعية والكمية وتوصيف الحمل البكتيري داخل الخلايا في الخلايا المضيفة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تلقيح الخلايا

1. ابدأ بزراعة الخلايا الظهارية البشرية A549 في وسط النسر المعدل (DMEM) عالي الجلوكوز مع الفينول الأحمر ، مع مصل بقري الجنين بنسبة 10٪ بدون مضادات حيوية.
2. راقب كل بئر من الصفيحة المكونة من 24 بئرا عن طريق الفحص المجهري منخفض التكبير للتأكد من أن الخلايا الظهارية البشرية صحية وتنمو كما هو متوقع.
3. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا المستهلكة والتخلص منه من اللوحة المكونة من 24 بئرا.
4. أضف 500 ميكرولتر من المعلق البكتيري للمكورات العنقودية الذهبية المحضرة في DMEM بدون أحمر الفينول ، لتلقيح كل بئر بخلايا ملتصقة بنسبة 100٪.
5. احتضان الخلايا لمدة ساعتين عند 36 ± 1 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   ملاحظة: يوصى باستخدام ثلاثة آبار من اللوحة لكل حالة يتم اختبارها (ثلاث نسخ) وإجراء ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. يمكن تكييف تأخير الحضانة وفقا للهدف التجريبي.

< p class = "jove_title" >2. القياس الكمي للبكتيريا داخل الخلايا مع مقايسة حماية الإنزيم المحسنة (iEPA)

1. تحضير 7 مل من محلول التحلل 4x مع 3.5 مل من 2٪ Triton X-100 في الماء المعقم و 3.5 مل من التربسين-EDTA.
2. تحضير محلول مخزون الليزوستافين عند 10 مجم / مل في محلول الأسيتات و aliquot 25 ميكرولتر في التبريد. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
3. تحضير 250 ميكرولتر من محلول عمل الليزوستافين الطازج عند 1 مجم / مل عن طريق خلط 25 ميكرولتر من محلول مخزون الليزوستافين (10 مجم / مل) و 225 ميكرولتر من 0.1 م Tris-HCl. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة.
4. قم بإعداد 6.25 مل من وسط العدوى الكامل المكمل بالليزوستافين عن طريق إضافة 6 مل من وسط العدوى الكامل إلى 250 ميكرولتر من محلول عمل الليزوستافين.
5. أضف 250 ميكرولتر من وسط العدوى الكامل المكمل بالليزوستافين في كل بئر وقم بتحريك اللوحة برفق عن طريق تدوير اللوحة يدويا.
6. احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 36 ± 1 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ للسماح لليزوستافين بقتل البكتيريا خارج الخلية.
7. في نهاية وقت الحضانة ، أضف 10 ميكرولتر من البروتيناز K عند 20 مجم / مل في كل بئر لتعطيل الليزوستافين.
8. احتضان الخلايا لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
9. أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل 4x لتحلل الخلايا عن طريق الصدمة التناضحية.
10. احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق عند 36 ± 1 درجة مئوية.
11. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عشر مرات في جميع أنحاء قاع البئر للتأكد من أن الخلايا متجانسة وتجانسها بالكامل.
12. استخدم طبقا حلزونيا أوتوماتيكيا لتحديد المكورات العنقودية الذهبية حمولة كل بئر.
13. احتضان ألواح الأجار لمدة 18-24 ساعة عند 36 ± 1 درجة مئوية.
14. في اليوم التالي ، احسب عدد المستعمرات باستخدام عداد مستعمرة لحساب الحمل داخل الخلايا S. aureus لكل بئر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات طبق 24 بئر كورنينج فالكون 353047 خط خلية A549 ATCC CCL-185 محلول عازل الأسيتات درجة الحموضة 4.6 فلوكا 31048 يستخدم لتحضير محلول مخزون الليسوستباهين عند 10 مجم / مل في 20 ملي من أسيتات الصوديوم. أمبيسين (ليزوستافين المؤتلف) أمبي إل إس بي إن-50 ليزوستافين المجفف بالتجميد. قم بالتجميد عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. COS - كولومبيا أجار + 5٪ دم أغنام بيومريو 43049 يمكن استخدام أي صفيحة أجار مناسبة لزراعة المكورات العنقودية بدلا من ذلك. Dulbecco's Modified Eagle's Medium, نسبة عالية من الجلوكوز مع الفينول الأحمر سيجما ألدريتش د6429 النسر المعدل من Dulbecco متوسط ، عالي الجلوكوز بدون فينول أحمر سيجما ألدريتش د1145 محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco سيجما ألدريتش د8537 محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco مع MgCl2 و CaCl2 ، مفلتر معقم سيجما ألدريتش د8662 محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco ، مفلتر معقم سيجما ألدريتش د8537 تخفيف سهل الحلزوني بين العلوم 414000 مخفف أوتوماتيكي وفلتر حلزوني مصل الأبقار الجنينية جيبكو 10270-106 بروتيناز ك ، مؤتلف 20 مجم / مل يوروبيو GEXPRK01-ب5 > 30 وحدة / ملغ ، 901727 الكمية مسح ضوئي 4000 بين العلوم 438000 عداد مستعمرة أوتوماتيكي ماء معقم أوتك 600500 TC20 عداد الخلايا الآلي بيوراد 1450102 عداد خلوي أوتوماتيكي تريس 1 م درجة الحموضة 8.0 إنفيتروجين AM9855G يستخدم لتحضير محلول عمل الليزوستافين عند 1 مجم / مل في 0.1 M Tris-HCl. تريتون X-100 سيجما ألدريتش تي 8787 التربسين - محلول EDTA سيجما ألدريتش تي 3924 0.05٪ تربسين خنزير و 0.02٪ EDTA في محلول الملح المتوازن من هانكس مع الفينول الأحمر مجهر مضان واسع المجال نيكون تي آي 2