الفحص اللوني القائم على سلفونات البثوفيانثرولين: طريقة بسيطة وسريعة لقياس كمية الحديد غير الهيم في أنسجة كبد الفأر

الملخص

المصدر: Duarte ، T. L. ، Neves ، J. V. قياس محتوى الحديد غير الهيم في الأنسجة باستخدام مقايسة لونية قائمة على الباتوفينانثرولين. J. Vis. Exp. (2022)

في هذا الفيديو ، نصف طريقة قائمة على قياس الألوان لتحديد محتوى الحديد غير الهيم في أنسجة كبد الفئران. يستخدم سلفونات البثوفيانثرولين كركيزة كروموجينيك في وجود عامل اختزال ، والذي يحول الحديد الحديديك إلى حديد حديدي قابل للخلص.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE

< p class = "jove_title" >1. إعداد الحل

ملاحظة: تعامل مع جميع الكواشف والمحاليل وقم بإعدادها باستخدام الأواني الزجاجية الخالية من الحديد أو الأواني البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة. لا تسمح لمواد المختبرات المعدنية (مثل ملاعق الفولاذ المقاوم للصدأ) بالتلامس مع أي كاشف أو محلول ، بسبب خطر تلوث الحديد. تأكد من أن أي أواني زجاجية قابلة لإعادة الاستخدام خالية من الحديد. اغسل المواد بمنظف المختبر المناسب لمدة 30-60 دقيقة ، واشطفها بالماء منزوع الأيونات ، وانقعها طوال الليل في محلول حمض النيتريك بنسبة 37٪ مخفف بنسبة 1: 3 بالماء منزوع الأيونات ، واشطفها مرة أخرى بالماء منزوع الأيونات ، واتركها حتى تجف.

1. خليط حمضي: أضف 10 جم من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك إلى 82.2 مل من حمض الهيدروكلوريك بنسبة 37٪ في زجاجة زجاجية ، ثم قم بإذابتها جيدا ، واضبط الحجم النهائي على 100 مل بالماء منزوع الأيونات. رج العبوة قبل الاستخدام. بدلا من ذلك ، استخدم 37٪ فقط من حمض الهيدروكلوريك لهضم الأنسجة.
   ملاحظه: المحلول مستقر لمدة شهرين على الأقل عند تخزينه في زجاجات كاشف زجاجي بني غامق.
   أنذر: حمض الهيدروكلوريك وحمض ثلاثي كلورو أسيتيك مسببان للتآكل ، وتطلق الأشكال المركزة أبخرة حمضية سامة. ارتد ملابس واقية وقفازات مقاومة للمواد الكيميائية ونظارات رذاذ كيميائية في جميع الأوقات عند التعامل مع الأحماض. تجنب استنشاقها وتعامل دائما مع الأحماض تحت غطاء الدخان.
2. أسيتات الصوديوم المشبعة: أضف 228 جم من أسيتات الصوديوم اللامائية إلى 400 مل من الماء منزوع الأيونات في زجاجة زجاجية وحركه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. دع المحلول يرتاح ويترسب ليوم واحد. في حالة عدم حدوث هطول الأمطار ، استمر في إضافة كميات صغيرة من أسيتات الصوديوم. قم بتخزين المحلول في زجاجة زجاجية.
3. كاشف الكروموجين: لتحضير 1 مل من كاشف الكروموجين ، أضف 1 مجم من ملح ثنائي الصوديوم 4،7-ثنائي الفينيل -1،10-الفينانثرولين ثنائي السلفونيك إلى 500 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات و 10 ميكرولتر من حمض الثيوغليقوليك المركز (100٪) ، وقم بإذابته تماما. اصنع الحجم النهائي إلى 1 مل بالماء منزوع الأيونات.
   ملاحظه: قم بإعداد أكبر قدر ممكن من كاشف الكروموجين حسب الحاجة. الحل مستقر لمدة 1 شهر عند حمايته من الضوء.
4. كاشف الكروموجين العامل (WCR): أضف حجما واحدا من كاشف الكروموجين إلى 5 أحجام من أسيتات الصوديوم المشبعة و 5 أحجام من الماء منزوع الأيونات.
   ملاحظه: يجب تحضير هذا المحلول طازجا في يوم الاستخدام.
5. محلول قياسي للحديد المخزون: لتحضير محلول حديد سعة 20 ملي مولار ، ضع 111.5 مجم من مسحوق الحديد الكربونيل في قارورة حجمية سعة 250 مل تحتوي على 5,480 ميكرولتر من 37٪ حمض الهيدروكلوريك. اتركيه ليذوب طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (أو احتضانه في حمام مائي مغلي). ثم قم بتكوين المحلول بحجم نهائي يبلغ 100 مل بالماء منزوع الأيونات.
   ملاحظه: يمكن الاحتفاظ بالمحلول القياسي إلى أجل غير مسمى عند تخزينه في وعاء محكم الإغلاق.
6. محلول حديد العمل القياسي (WISS): أضف 13.5 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك بنسبة 37٪ إلى 500 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. أضف 10 ميكرولتر من محلول الحديد القياسي وقم بتعويض الحجم النهائي إلى 1 مل بالماء منزوع الأيونات (11.169 ميكروغرام من الحديد / مل ، 200 ميكرومتر ؛ مقاس بواسطة AAS).
   ملاحظه: يجب تحضير حل العمل طازجا في يوم الاستخدام.

فئة < p = "jove_title" >2. تجفيف العينة

1. قطع عينة من الأنسجة تزن 10-100 مجم بشفرة مشرط. قم بوزنها بدقة في ميزان تحليلي / دقيق فوق قطعة صغيرة من البارافيلم (الوزن الطازج).
2. باستخدام ملاقط بلاستيكية ، ضع قطعة الأنسجة في صفيحة من 24 بئرا (غير مغطاة للسماح بتبخر الماء) واتركها تجف على حاضنة قياسية عند 65 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
3. بدلا من ذلك ، استخدم فرن الهضم بالميكروويف المختبري لتجفيف عينات الأنسجة. باستخدام ملاقط بلاستيكية ، ضع قطعة الأنسجة الموزونة في كوب تفلون خال من الحديد وجففها في الميكروويف. قم بتعيين معلمات التشغيل وفقا لدليل تعليمات الجهاز.
   ملاحظه: كمرجع ، يتم عرض معلمات التشغيل لتجفيف عينات الكبد باستخدام فرن الهضم المحدد (انظر جدول المواد) في الجدول 1.
4. باستخدام ملاقط بلاستيكية ، ضع كل قطعة مجففة من الأنسجة فوق قطعة صغيرة من البارافيلم داخل ميزان تحليلي / دقيق ووزنها بدقة (الوزن الجاف).

< p class = "jove_title" >3. عينة من الهضم الحمضي

1. باستخدام ملاقط بلاستيكية ، انقل كل قطعة مجففة من الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
2. أضف 1 مل من خليط الحمض وأغلق أنبوب الطرد المركزي الدقيق. قم بإعداد فارغ حمضي بنفس الطريقة ، باستثناء حذف الأنسجة.
   أنذر: الخليط الحمضي تآكل ويطلق أبخرة سامة. ارتد ملابس واقية وقفازات مقاومة للمواد الكيميائية ونظارات رذاذ كيميائية عند التعامل مع خليط الحمض. تجنب استنشاقه وتعامل معه دائما تحت غطاء الدخان.
3. هضم الأنسجة عن طريق احتضان أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في حاضنة عند 65 درجة مئوية لمدة 20 ساعة.
4. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة، انقل 500 ميكرولتر من مستخلص الحمض الصافي (الطافي) إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل باستخدام ماصة دقيقة مزودة بأطراف بلاستيكية. إذا لم يكن من الممكن الحصول على مادة طافية واضحة ، فقم بإجراء دورة قصيرة للطرد المركزي.
   أنذر: المادة الطافية شديدة الحموضة. ارتد ملابس واقية وقفازات مقاومة للمواد الكيميائية ونظارات رذاذ كيميائية عند التعامل مع المواد الطافية. تعامل معها دائما تحت غطاء الدخان.
   ملاحظه: في هذه المرحلة ، يمكن استخدام المستخلصات الحمضية على الفور في الفحص اللوني أو تجميدها عند -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا. قم بإذابة العينات المجمدة تماما إلى درجة حرارة الغرفة وقم بتدويرها قبل الاستخدام.

< p class = "jove_title" >4. تطوير اللون

1. قم بإعداد تفاعلات الكروموجين كما هو موضح في الجدول 2 في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل أو ، للحصول على إنتاجية أعلى ، مباشرة في القاع المسطح ، 96 بئر ، صفائح البوليسترين الدقيقة الشفافة وغير المعالجة. قم بإعداد جميع التفاعلات (حمض فارغ ، قياسي ، وعينة) على الأقل في نسختين.
2. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

< p class = "jove_title" >5. قراءة الامتصاص

1. قم بقياس امتصاص العينة في مقياس الطيف الضوئي أو قارئ اللوحة بطول موجي يبلغ 535 نانومتر مقابل مرجع مائي منزوع الأيونات. يمكن قراءة اللوحات بدون غطاء أو غطاء. في العلبة ذات الغطاء ، قم بإزالة أي تكاثف يتكون بسبب إطلاق أبخرة حمضية من الغطاء قبل القياس مباشرة لتجنب التداخل المحتمل مع قراءة الامتصاص.
   ملاحظه: يجب أن يكون الامتصاص البصري للحمض الفارغ المقروء مقابل الماء منزوع الأيونات (المرجع) أقل من 0.015 ؛ يجب أن يكون الامتصاص البصري للمعيار والعينات بين 0.100 و 1.000. بالنسبة للعينات ذات المحتوى المرتفع جدا أو المنخفض جدا من الحديد ، قد يلزم تعديل أحجام المستخلص الحمضي (طاف) و diH₂O (الجدول 2): إذا كان الامتصاص أكبر من 1.0 ، فاستخدم حجم عينة أصغر (طاف). عندما يكون الامتصاص أقل من 0.1 ، استخدم حجما أكبر من المادة الطافية. يؤخذ حجم العينة (Vsmp) في الاعتبار عند حساب محتوى الحديد الأنسجيفي لكل عينة (انظر الخطوة 6).

فئة

6. حساب محتوى الحديد الأنسجيفي

1. احسب محتوى الحديد في أنسجة غير الهيم بالمعادلة التالية:
   
   أنسجة الحديد (ميكروغرام / غرام من الأنسجة الجافة) = المعادلة 1
   AT = امتصاص عينة الاختبار
   AB = امتصاص الحمض الفارغ
   AS = امتصاص المعيار
   Fes = تركيز الحديد ل WISS (ميكروغرام Fe / mL)
   W = وزن الأنسجة الجافة (جم)
   Vsmp = حجم العينة (الحجم المتغير للطافية في الجدول 2 تم تحويله إلى مل)
   Vf = الحجم النهائي للخليط الحمضي بعد الحضانة الليلية عند 65 درجة مئوية (المقابل للحجم الحمضي بالإضافة إلى حجم الأنسجة الجافة بالمل ؛ إذا لم تختلف أوزان العينة اختلافا كبيرا ، افترض حجما ثابتا ≈ 1 مل)
   Vstd = الحجم القياسي للحديد (حجم WISS في الجدول 2 محول إلى مل)
   Vrv = حجم التفاعل النهائي (الحجم الكلي في الجدول 2 محول إلى مل)

< p class = "jove_content" >الجدول 1: معلمات التشغيل لتجفيف الكبد في فرن الهضم بالميكروويف المستخدم هنا قوة 650 واط (٪): 10 15 20 25 30 الضغط (PSI): 0 0 0 0 0 الوقت (دقيقة): 10 15 30 30 40 وقت الضغط (TAP): 0 0 0 0 0 مروحة: 50 50 50 50 50 فئة

الجدول 2: تحضير تفاعلات الكروموجين إما في أنابيب 1.5 مل أو ألواح 96 بئر.

WCR (ميكرولتر) خليط الحمض (ميكرولتر) طافي (ميكرولتر) WISS (ميكرولتر) diH₂O (μL) الحجم الكلي (ميكرولتر) 1.5 مل أنابيب حمض فارغ 1000 150 حيا 150 حيا 1300 معيار 1000 150 حيا 150 حيا 1300 عينة 1000 متغير متغير 1300 96 بئر صفيحة دقيقة حمض فارغ 150 حيا 22.5 22.5 195 معيار 150 حيا 22.5 22.5 195 عينة 150 حيا متغير متغير 195

المواد