$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.
< p class = "jove_title" >1. توسيع أسلاف OC
- قم بإعادة تعليق PBMCs في α-MEM الكامل (FBS 10٪ ، 1٪ قلم/بكتيريا Strep ، 1٪ أمفوتريسين B) تحتوي على 20 نانوغرام / مل لتر M-CSF. بذور PBMCs بكثافة 2.5 × 105 خلايا / سم2. عادة ، يمكن زرع الخلايا المعزولة من 15-20 مل من الدم الطازج في قارورة واحدة مقاس 75 سم2 (1.5-2 × 107 خلايا).
- قم بتغذية الخلايا ب α-MEM الطازج الكامل الذي يحتوي على 20 نانوغرام / مل M-CSF كل ثلاثة أيام حتى تصل الخلايا المرفقة إلى التقاء المطلوب. الغلة النموذجية هي 1.5-2 × 106 خلايا / قارورة عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 95٪. عادة ، تستمر فترة التوسع 6 أيام.
ملاحظه: يمكن أن تنخفض إمكانات تقوية العظم للسلائف مع وقت الزراعة الطويل.
< p class = "jove_title" >2. تحريض تكوين العظم في الألواح المطلية بفوسفات الكالسيوم
- لتسهيل التصاق الخلية ، قم باحتضان الألواح المطلية بفوسفات الكالسيوم (CaP) مع 50 ميكرولتر من FBS لمدة ساعة واحدة في حاضنة 37 درجة مئوية.
- لفصل سلائف OC ، اغسل القارورة باستخدام PBS مرتين لإزالة الخلايا الميتة أو غير الملتصقة. أضف 4 مل من التربسين (جدول المواد) لكل قارورة 75 سم2 لمدة 30 دقيقة.
- أضف 4 مل من α-MEM الكامل لوقف الهضم ، وافصل الخلايا بعناية باستخدام مكشطة الخلايا وانقل الخلايا إلى أنبوب سعة 50 مل.
- حدد العدد الإجمالي للخلية باستخدام غرفة Neubauer أو ما شابه ذلك.
- قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 350 × جم. أعد تعليق الحبيبات في α-MEM كاملة كافية تحتوي على 20 نانوغرام / مل M-CSF و 20 نانوغرام / مل RANKL للحصول على تركيز 1 × 106 خلايا / مل.
- شفط محلول FBS من صفيحة 96 بئرا مطلية ب CaP وماصة 200 ميكرولتر من معلق الخلية لكل بئر (2 × 105 خلايا / بئر).
- احتضان سلائف OC للفترة الزمنية المطلوبة أو مع الكواشف المرغوبة ذات الصلة بالتصميم التجريبي. عادة ، يمكن ملاحظة أعداد كبيرة من OCs الكبيرة ومتعددة النوى بعد 6 أيام وعندما تتشكل حفر الارتشاف. تغذية الخلايا بوسط α-MEM كامل طازج يحتوي على 20 نانوغرام / مل M-CSF و 20 نانوغرام / مل RANKL كل ثلاثة أيام.
- في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا باستخدام PBS مرتين ، وثبتها بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق ، واغسلها باستخدام PBS مرة أخرى.
- استخدم OCs الثابتة مباشرة لتلوين التألق أو قم بتخزينها عند 4 درجات مئوية.
فئة < p = "jove_title" >3. تلطيخ مضان OCs وطلاء فوسفات الكالسيوم
- احتضان الخلايا الثابتة مع المخزن المؤقت للنفاذية (0.1٪ تريتون في PBS) لمدة 5 دقائق.
- تلطيخ خيوط الأكتين مع 100 ميكرولتر من محلول الفالودين المسمى AlexaFluor 546 في PBS لمدة 30 دقيقة واستنشاق محلول التلوين. أضف 100 ميكرولتر من محلول التلوين Hoechst 33342 (10 ميكروغرام / مل في PBS) لمدة 10 دقائق لصبغة النوى. يمكن أيضا استخدام DAPI.
- طلاء CaP بصبغة 100 ميكرولتر من 10 ميكرومتر من الكالسيين في PBS لمدة 10 دقائق.